第一部分转录因子KLF5在缺氧性肺动脉高压中的作用目的：缺氧性肺动脉高压是一种复杂的系统性疾病,肺小动脉重构是其主要的病理特征。KLF5(Kruppel-like factor5)作为一种锌指结构的转录因子,参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化以及迁移过程。它在肺动脉高压病人的肺动脉平滑肌细胞中高表达。研究发现KLF5参与了心血管重构的形成过程。然而,目前KLF5在缺氧性肺动脉高压中的作用及分子机制尚不清楚。方法：实验采用成年雄性SD大鼠(体重为200-250g),分别置于常氧或缺氧环境(10%氧浓度)中培养。‘检测大鼠血流动力学指标,评估其肺动脉中膜厚度和右心室肥厚程度,行肺组织HE染色观测大鼠血管重构情况。在常氧或缺氧(5%氧浓度)培养箱中培养人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells, HPASMC)。在HPASMC中行CCK-8、BrdU标记、PI单染、Annexin-V/PI双染、transwell迁移实验检测细胞活力、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移能力。行免疫印迹、免疫组织化学、免疫荧光染色实验检测目的蛋白水平。行实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测目的基因mRNA水平。提取暴露于常氧和缺氧环境的HPASMC裂解产物,通过免疫共沉淀实验明确KLF5和缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-la, HIF-1α)之间是否存在关联。采用小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)下调HPASMC中KLF5和HIF-1α的表达。为上调KLF5水平,建立过表达KLF5基因的慢病毒载体并感染HPASMC。构建KLF5基因短发卡结构RNA (short hairpin RNA, shRNA)慢病毒载体,通过尾静脉注射入大鼠体内以下调KLF5表达。结果：缺氧组大鼠的平均肺动脉压力显著升高,伴随远端肺小动脉中膜增厚及右心室肥厚。缺氧引起大鼠肺动脉中膜层PCNA、Ki67阳性细胞增多,TUNEL阳性细胞减少。缺氧HPASMC的增殖和迁移能力增强,细胞凋亡减少。沉默KLF5或HIF-1α可以逆转这些生物学改变。在平滑肌细胞中,沉默KLF5后HIF-1α蛋白水平下调,过表达KLF5可以上调HIF-1α水平,而沉默HIF-1α后KLF5表达无显著改变。免疫共沉淀实验提示KLF5和HIF-1α存在直接结合,缺氧刺激下沉淀的目的蛋白增多。细胞周期蛋白cyclin B1、cyclin D1和凋亡相关蛋白bax、bc-2、survivin、caspase-3和caspase-9参与了KLF5-HIF-1α轴对HPASMC生长的调控。KLF5沉默大鼠的肺动脉中HIF-1α表达显著下调,平均肺动脉压和肺动脉重构情况显著改善,与细胞实验的结果一致。结论：缺氧促进肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移增加,凋亡减少,血管重构形成。本研究从细胞水平和在体水平验证了KLF5-HIF-1α轴存在于缺氧大鼠的肺动脉平滑肌细胞,并且在缺氧性肺血管重构中发挥了重要作用。KLF5是缺氧性肺动脉高压治疗的潜在靶点。第二部分转录因子KLF5在在缺氧对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡中的作用目的：转录因子KLF5在肿瘤组织中广泛表达,且是肿瘤的一个预后因子。然后,KLF5在非小细胞肺癌中的作用尚未阐明。缺氧通过HIF-1α在肿瘤的发展中起重要作用。本研究旨在探讨KLF5在缺氧性肺癌细胞生长中的作用以及KLF5和HIF-1α的潜在关联。方法：我们通过对暴露于常氧(20%氧浓度)或缺氧(1%氧浓度)环境的A549细胞进行CCK-8实验、克隆形成实验、CFSE标记实验、Annexin-V/PI实验检测细胞的活力、克隆形成能力、‘增殖和凋亡。通过合成小干扰RNA来下调KLF5和HIF-1α的表达。采用PCR和免疫印迹的方法检测mRNA和蛋白的表达水平。结果：研究显示缺氧可以增强A549细胞活力、克隆形成能力,促进增殖,抑制细胞凋亡。缺氧上调HIF-1α和KLF5的表达,呈时间依赖性。沉默KLF5和HIF-1α可以通过下调cyclin B1、survivin,上调caspase-3逆转缺氧引起的细胞活力增加和凋亡减少。免疫共沉淀实验提示KLF5和HIF-1α存在直接关联,且缺氧环境中沉淀的目的蛋白更多。此外,沉默KLF5可以降低HIF-1α的水平,而KLF5表达不受HIF-1α的影响,确定了KLF5是HIF-1α的上游调控因子。结论：本研究证实缺氧是一个促癌因素,在肺癌细胞中通过激活KLF5→HIF-1α→cyclin B1/survivin/caspase-3发挥作用。