不稳定型心绞痛(unstable angina, UA)是冠状动脉粥样硬化性心脏病的严重类型之一,是介于慢性稳定型心绞痛和急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)之间的中间临床综合征,它是AMI的前驱表现,UA患者一年内AMI发生率可达12%-13%,死亡率可达3%-18%。目前,UA的诊断主要基于临床症状、心电图和冠状动脉造影术,临床上尚缺乏用于早期诊断的敏感性生化指标。因此,寻找早期诊断分子标志物,已成为目前心血管领域的研究热点。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类长度约为20-24个核苷酸长度的非编码单链RNA分子,已被证实参与心血管的发育,在动脉粥样硬化性疾病的发展过程中发挥重要作用。miRNA能够以微泡、蛋白复合体等形式稳定存在于循环系统,它的这种特性为心血管疾病的分子诊断提供了物质基础。目前,芯片技术和qRT-PCR被广泛应用于血浆miRNA差异表达基因的筛选与验证工作。本研究旨在通过Exiqon LNA miRNA芯片技术和TaqMAN stem-loop miRNA定量PCR技术,比较分析UA患者与健康人群血浆miRNA的表达谱,筛选UA组血浆中差异表达和变异稳定的血浆miRNA分子,并进行定量PCR的验证。本研究技术路线：收集两批UA患者和健康人群血浆样本,分别用于血浆miRNA芯片检测和qRT-PCR的验证。通过芯片数据的前处理和数据分析,获得UA患者血浆中差异表达的候选分子；其次,收集第二批健康人群血浆样本,进行血浆和细胞RNU6B表达分析；以RNU6B表达量为基线水平,进行芯片数据后处理,获得可信度高的差异表达分子和内参分子。第三,通过定量分析验证UA患者差异表达候选基因miR-9-3p在UA患者以及健康体检人群血浆中是否存在显著差异,进一步研究miR-9-3p对HepG2细胞胆固醇代谢调节关键蛋白ATP结合盒转运蛋白A1 (ATP-binding Cassette Transporter A1, ABCA1)基因表达的影响,为miR-9-3p参与UA患者血脂调节提供佐证,以期为UA的早期临床诊断提供潜在的分子标记物。第一部分不稳定型心绞痛患者血浆miRNA表达谱特征分析目的：筛选UA患者血浆中差异表达miRNA分子。方法：本实验收集了175例健康体检人群血浆样本和150例UA患者血浆样本,分别制备成7个健康对照组血浆库样本和6个UA组血浆库样本。应用Exiqon miRCURY LNATM miRNA芯片技术,检测血浆中miRNA的表达水平。采用统计学分析软件R 3.0.2中limma基因芯片分析程序包进行miRNA芯片数据分析。结果：1研究对象基本特征本实验共入选UA患者150例(男性84名,女性66名),健康体检人员175名(男性109名,女性66名),两组间平均年龄分别为55±9岁、54±11岁。基本特征：性别、年龄、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C两组间比较无显著性差异(P>0.05) (Table1)。2血浆miRNA芯片数据获取与分析2.1血浆miRNA芯片数据归一化数据处理芯片数据归一化后,消除了芯片间的荧光信号的整体偏差。如Fig.1红色曲线所示,未经VSN归一化处理前,其平均值的标准偏差呈上升趋势；如Fig.2红色直线所示,经VSN归一化后,消除了芯片间信号的整体偏差。2.2血浆miRNA芯片数据的相关分析Spearman相关分析表明健康对照组和UA组血浆中miRNA表达谱具有可重复性,相关系数分析为0.87 ±0.08 (Table 2)和0.94 ±0.05 (Table 3)。2.3血浆miRNA芯片数据火山图volanno plot技术分析表明,两组间血浆中存在的大量差异表达miRNA分子(Fig 3左上象限和右上象限)。2.4 UA组血浆中miRNA的差异表达分析在UA患者血浆中,表达水平升高的miRNA共有207个(P<0.01),表达水平降低的miRNA共有134个(P<0.01)。小结：1通过Exiqon miRNA芯片技术,获得健康对照组和UA组血浆miRNA表达谱。第二部分经RNU6B血浆基线水平调整后UA患者血浆miRNA表达谱目的：通过RNU6B血浆基线水平调整,获得可信度高的UA患者血浆miRNA表达谱。方法：本实验选取健康体检人员10例(男性5例,女性5例)为研究对象,应用TaqMan探针miRNA实时荧光定量PCR技术检测其血浆中RNU6B、miR-423-5p以及miR191-5p的表达水平,以HepG2细胞为研究对象,通过体外细胞培养技术、实时荧光定量PCR检测HepG2细胞RNU6B的表达量。实验数据采用2-△CT进行分析,两个独立样本采用t检验或Mann-Whitney U检验。应用SPSS16.0统计软件对实验结果进行分析,GraphPAD Prism 5.0软件对实验数据进行作图,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1健康体检人群基本特征临床资料统计示：研究对象平均年龄为43±6岁、男女比例1：1、空腹血糖(FPG)为5.15±0.56mmoL/L、总胆固醇(TC)为4.95±0.77mmoL/L、甘油三酯(TG)为1.13±0.35 mmoL/L、高密度脂蛋白(HDL-C)为1.04±0.32mmoL/L、低密度脂蛋白(LDL-C)为2.94±0.81 mmoL/L (Table4)。2应用实时荧光定量PCR技术检测10名健康体检人员血浆RNU6B、 miR-423-5p、miR-191-5p表达情况。2.1 RNU6B表达水平的横向比较血浆中RNU6B表达水平显著低于HepG2细胞内RNU6B表达水平(1.26×10-11 vs 2.04×10-8; P<0.001) (Table 5, Fig.4)2.2血浆中RNU6B和miR-423-5p表达水平分析血浆中RNU6B表达水平显著低于血浆miR-423-5p表达水平(1.26×10-11 vs 7.94×10-8; P<0.001) (Table 6, Fig.4)2.3血浆中RNU6B和miR-191-5p表达水平分析血浆中RNU6B表达水平显著低于血浆中miR-191-5p表达水平(1.26×10-11 vs 1.03×10-8;,P<0.001) (Table6、Fig.4)。2.4血浆中miR-508-3p和miR-509-5p的qRT-PCR的扩增循环数高于40Ct值,超出了qRT-PCR的检出范围,略低于RNU6B的扩增循环数35-40。3 RNU6B基线水平调整UA组与健康对照组血浆miRNA表达谱RNU6B基线调整前后,UA组和健康对照血浆表达谱特征发生显著变化,差异有统计学意义(P<0.001; Table7, Fig.5)。RNU6B基线调整前,UA组较健康对照组血浆中共有207个miRNA分子的表达水平增高,134个miRNA分子的表达水平降低；基线调整后,表达水平升高的miRNA分子减少至124个 miRNA (Table 8),表达水平降低的niRNA分子减少至88个(Table 9)。经基线调整后,两组间变异度稳定的miRNA由938个减少至355个提示未经基线调整的芯片数据含有大量没有生物学意义的信号。Table 10为变异度相对稳定且呈高水平表达的30个miRNA分子,其中包括被推荐作为内参使用的has-miR-423-5p。小结：1血浆中RNU6B的水平显著性低于细胞内的表达水平。2 RNU6B基线调整后,UA组和健康对照血浆表达谱特征发生显著变化,为miRNA芯片数据后处理分析提供了实验依据。第三部分miR-9-3p在不稳定型心绞痛患者血浆表达水平分析及对ABCA1表达水平的影响目的：验证miR-9-3p血浆表达水平在健康体检人群以及UA患者是否存在显著差异,判断miR-9-3p对UA的诊断意义；从胆固醇代谢角度,探讨其对HepG2细胞胆固醇代谢调节因子ABCA1转录水平以及蛋白水平表达的影响。方法：本实验选取UA患者30例,其中男性15例；女性15例；年龄、性别匹配的健康体检人员28例,其中男性14例女性14例。采用mirVana miRNA纯化技术和TaqMan探针stem-loop miRNA定量PCR技术,检测两组血浆中miR-9-3p的表达水平。通过ROC曲线,判断miR-9-3p对UA的诊断价值。以HepG2细胞为体外模型,通过细胞培养技术、体外转染技术、实时定量PCR技术以及Western blotting免疫印迹技术,从转录水平和翻译水平,研究miR-9-3p对HepG2细胞ABCA1基因表达的影响。临床计数资料使用n(%)表示,计量资料使用均数士标准差表示；两组间数据比较计数变量采用卡方检验,计量数据两组间比较采用t检验。实验数据采用2-△CT法进行分析,应用中位数(四分位间距)来表示,’相对表达倍数用2-△Ct表示,两组数据比较采用非参数t检验,应用ROC曲线分析计算出AUC曲线下面积和95%可信区间。P<0.05表示差异有统计学意义,SPSS16.0以及GraphPAD Prism 5.0统计软件对实验结果进行统计分析及作图。结果：1受试者人群的基本特征1.1为了进行血浆miRNA差异表达验证,收集健康体检人群28例(男性14例；女性14例),平均年龄为56±8岁；UA组30例(男性15例；女性15例),平均年龄为56士10岁(Table 11)。1.2 UA组和对照组的基本资料比较：两组间性别、年龄、FPG、TC、TG、 HDL、LDL差异无统计学意义(P>0.05) (Table 11).2 UA组血浆中miR-9-3p的差异表达验证UA组血浆中miR-9-3p的相对表达水平显著低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.0001, Fig.6; Table 12)。ROC曲线分析显示：ROC曲线下面积(AUC)值为0.839,P<0.0001,95%置信区间CI为：0.720-0.958(Fig 7)。其AUC值介于0.7-0.9之间,说明miR-9-3p对UA的诊断具有一定的准确性。3 miR-9-3p对]HepG2细胞ABCA1基因表达的影响3.1应用qRT-PCR技术检测HepG2细胞miR-9-3p mimics转染效率qRT-PCR结果显示,转染组HepG2细胞中miR-9-3p表达水平较阴性对照组升高了22.58倍,差异有统计学意义(P<0.001; Fig.8)。3.2 miR-9-3p对HepG2细胞ABCA1基因mRNA转录水平的影响qRT-PCR结果显示,两组间ABCA1 mRNA水平无显著性差异(Fig.9; P=0.583)。3.3 miR-9-3p对HepG2细胞ABCA1蛋白水平的影响通过Western blot技术检测miR-9-3p对HepG2细胞ABCA1蛋白水平的变化。分析结果显示,miR-9-3p转染组ABCA1的蛋白水平显著低于对照组,差异具有统计学意义(Fig.10、Fig.11; P=0.03)小结：1不稳定型心绞痛患者血浆中miR-9-3p的表达水平显著降低,血浆miR-9-3p有可能成为UA诊断的分子标志物之一。2 miR-9-3p通过转录后水平抑制ABCA1蛋白的表达。