论文部分内容阅读
目的:本项目主要观察扶正祛毒汤对急性T淋巴细胞白血病完全缓解(Acute T lymphoblastic leukemia Complete Remission,T-ALL-CR)患者 CD34+细胞源树突细胞(Dendritic Cell,DCs)的诱导作用,并且通过激活T细胞+CEM细胞的方式观察T细胞对CEM细胞的杀伤作用,探讨中药复方扶正祛毒汤对急性T淋巴细胞白血病完全缓解期患者DCs免疫功能的影响。方法:1.用扶正祛毒汤以高、中、低不同剂量连续3天于早、中、晚定时灌胃新西兰大白兔,设正常对照组,并于末次灌胃2h后在无菌条件下行心脏取血,采集含药兔血清及正常兔血清以备用。2.在无菌条件下行骨髓穿刺收集T-ALL-CR患者的骨髓,采用Ficoll密度梯度离心获得骨髓单个核细胞,用免疫磁珠分离法获得CD34+细胞,将采集的CD34+细胞加入细胞因子如干细胞生长因子(Stem Cell Factor,SCF)、血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)、白细胞介素-3(Interl-eukin-3,IL-3)、FMS 样酪氨酸激酶-3(FMS-like tyrosine kinase-3,Flt-3)共同培养9天以促进CD34+细胞数量的扩增。3.利用自动细胞计数仪将培养的CD34+细胞数量调整至1×106/ml后与第一步中制备的高、中、低不同剂量中药含药兔血清共同培养,此过程需加入细胞因子如干扰素-α(Interferon-α,IFN-α)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、单核-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor,GM-CSF)、白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)共同培养诱导DCs,实验可分为扶正祛毒汤高剂量+细胞因子组(FQG+XB)、扶正祛毒汤中剂量+细胞因子组(FQZ+XB)、扶正祛毒汤低剂量+细胞因子组(FQD+XB)、细胞因子组(XB)、正常兔血清组(ZC),予隔日半量更换培养液,利用倒置显微镜进行观察各组诱导培养细胞的形态及数目,细胞培养过程中将细胞用台盼蓝染色后采用细胞计数仪观察各组诱导培养细胞的活力。4.收集培养9天后的细胞,利用流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)检测 DCs 表面特异性抗原 CD 1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达。5.收集从正常人及T-ALL-CR患者外周血分离纯化得到的T细胞,与CD34+细胞来源的DCs以10:1比例放入24孔培养板培养4-5天,将激发后的T细胞与CEM细胞分别以不同效靶比(10:1,20:1,40:1)放入96孔板培养24h,采用MTT法检测实验五组中经过DCs激发后的T细胞对CEM细胞的特异杀伤效应。结果:1.通过倒置显微镜观察发现高、中、低不同剂量中药含药兔血清+细胞因子组与细胞因子组均能诱导生长出具有典型细胞学形态特征的DCs,且总体上中药含药兔血清+细胞因子组培养的DCs细胞形态较单纯细胞因子组典型,数目也更多,但是不同剂量中药含药兔血清+细胞因子组之间并没观察到细胞形态及数目的明显差异,正常兔血清组未观察到典型DCs的生长。2.DCs免疫表型:T-ALL-CR患者骨髓经过分离后的单个核细胞在扶正祛毒汤含药兔血清培养下可诱导出具有DCs特异性免疫表型的细胞。诱导后期,CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR在各实验组均有表达,不同剂量含药兔血清+细胞因子组、细胞因子组的表达率高于正常兔血清组,有统计学意义(P<0.05)。3.DCs激发正常人、患者外周血T细胞对CEM细胞的杀伤作用:相同效靶比进行比较时,高、中、低不同剂量含药兔血清+细胞因子组激活正常人及T-ALL-CR患者T细胞对CEM细胞的杀伤率高于细胞因子组和正常兔血清组,有统计学意义(P<0.05)。在相同效靶比不同剂量含药兔血清+细胞因子组激活正常人T细胞对CEM细胞的杀伤率与激活T-ALL-CR患者T细胞对CEM细胞的杀伤率没有统计学差异(P>0.05)。不同效靶比时,比较正常兔血清组、不同浓度剂量含药兔血清+细胞因子组激活T-ALL-CR患者T细胞对CEM细胞的杀伤率,当效靶比为40:1时比10:1及20:1有统计学意义(P<0.05)。相同效靶比进行比较时,同一组别的正常人和患者之间比较杀伤率无统计学差异(P>0.05)。结论:1.扶正祛毒汤含药兔血清能促进T-ALL-CR患者CD34+细胞源DCs的分化与成熟。2.扶正祛毒汤含药兔血清诱导的DCs能激发患者和正常人外周血T细胞发挥对CEM细胞的杀伤作用,具有良好的生物学效应。3.T-ALL-CR患者外周血T细胞具有正常免疫功。