植物生物反应器被认为是最经济和最安全的天然生物反应器。通过植物作为反应器来生产外源蛋白的植物病毒表达系统,是目前极具有发展潜力的新型平台。内源蛋白酶胞内水解外源重组蛋白致使其终产物积累量低是平台向商业化迈进的“瓶颈”问题。抑制重组蛋白胞内降解相关蛋白酶是打破桎梏的关键。前人研究表明,特定的保护性标签能够提高外源重组融合蛋白在胞内的积累,共表达蛋白酶抑制剂(Protease inhibitors,PIs)可以原位保护重组蛋白。基于此,我们以rPA为研究对象,从保护性标签和共表达PIs两方面入手开展研究。通过构建不同类型保护性标签与rPA融合的病毒表达载体,对重组融合蛋白在接种叶片中的表达情况进行分析,探索保护性标签对重组蛋白在植物中积累的影响;通过构建蛋白酶抑制剂植物二元表达载体,与病毒表达载体共接种,探索共表达蛋白酶抑制剂对重组蛋白在植物中积累的影响。主要研究结果与结论如下:(1)HFB标签融合表达策略未能在受体植物本氏烟叶片中检测到稳定表达。推测认为,HFB标签在外源基因表达中的作用可能受与其融合的外源基因种类的影响,HFB标签与rPA间可能存在着“不相容性”。(2)ELP标签并未能有效的提高和保护与其融合的重组rPA的胞内积累。考虑到ELP标签长度对其融合蛋白的保护作用存在着一定程度的相关性,推测实验中使用的ELP30标签可能不是重组rPA的最适标签“伴侣”,适用于rPA的ELP标签需要进一步的实验筛选。(3)Zera标签在一定程度上提高了与其融合的rPA蛋白表达量。由于提取过程中需要加入还原剂才能从不溶态微粒转变为可溶形式,因而建议在实际应用应采用谨慎态度对待。(4)在非复制型病毒载体与PIs组成的共表达体系中,3种供试的PIs(SlCYS8,NbPR4和HsTIMP)均对内质网或者胞外表达的重组rPA积累具有显著的竞争抑制效应,PIs共表达竞争抑制效应具有一定程度的普遍性。PIs共表达竞争抑制效应的程度高,推测竞争抑制掩盖了 PIs对外源重组蛋白的原位保护作用,致使观察到的重组蛋白积累量低于其正常时的积累水平。(5)PIs共表达所产生的竞争抑制效应与PIs丰度直接相关,竞争抑制效应随着PIs丰-度的下降而减弱。通过体外改变共接种混合菌液中PIs的接种比例,可以在一定程度上缓解竞争抑制效应程度,进而有限度地提高共表达外源重组蛋白的积累。(6)在复制型病毒与PIs组成的共表达体系中,重组rPA的积累未受到明显的抑制且重组rPA在内质网中的积累与PIs接种浓度呈现正相关关系,表明通过病毒复制在体内下调PIs相对丰度可以有效弱化竞争抑制效应。3种PIs对外源重组蛋白的积累提高了 3-12倍,说明共表达复制型病毒载体策略具有一定的实际应用潜力和价值,为PIs合理使用提供了新的思路。相关研究结果为解决植物病毒表达平台商业化进程中所面临“瓶颈”背后的关键共性问题提供了参考,为推动植物病毒表达系统的商业化进程奠定理论和实践基础。