背景: 骨缺损是临床上十分常见的问题，骨缺损修复材料需求量巨大。自体骨、异体骨和人工骨替代材料等传统治疗方法都存在一定的缺陷，为克服这些缺陷而构建的组织工程骨为骨缺损的修复提供了一条新的途径。大量的动物实验证实组织工程骨是一种理想的骨缺损修复材料，其临床应用研究也显示组织工程骨具有良好的成骨效果。种子细胞是构建组织工程骨的一个关键因素，要求具有较强的增殖能力和成骨分化能力，骨髓间质干细胞(MSCs)是应用最广泛的一种种子细胞。然而目前一些研究在应用MSCs构建组织工程骨时所选择的培养代数和接种密度各不相同，传代培养将直接影响MSCs的增殖能力和成骨分化能力，不合适的接种密度则不利于支架材料中细胞间微环境的建立和细胞的营养代谢，二者将最终影响组织工程骨骨缺损修复能力。为进一步提高组织工程骨骨缺损修复能力，适应骨组织工程产业化发展的趋势，有必要对骨组织工程种子细胞——MSCs在培养代数和接种密度的选择方面给于足够的重视。 目的: 1．观察MSCs的体外生长特性，探讨传代培养对MSCs体外增殖能力和成骨分化能力的影响，为组织工程骨的构建选择一合适培养代数的MSCs。 2．探讨MSCs接种密度对组织工程骨骨缺损修复能力的影响，为组织工程骨的构建筛选出一合适的接种密度。 方法: 1．MSCs细胞形态学观察：应用Percoll细胞分离液对兔骨髓行密度离心，分离得到MSCs并传代，观察各代MSCs生长状况；取第四代MSCs行成骨分化诱导培养，观察MSCs在成骨分化条件下的生长状况，分别行改良的Kaplow法染色和改良的Von Kossa法染色，检测MSCs成骨分化诱导培养后碱性磷酸酶的表达和钙化节结的形成。 2．第1-5代MSCs增殖能力检测：应用四唑盐(MTT)比色法检测第1-5代MSCs传代培养后各时间点的OD值，采用统计学方法比较各代MSCs的增殖能力。 3．第1-5代MSCs成骨分化能力检测：应用碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒检测第1-5代MSCs成骨分化诱导培养后的ALP活性，采用统计学方法比较各代MSCs的成骨分化能力。 4．术后大体观察和影像学检查：取第4代的同种异体MSCs进行成骨分化诱导培养，配成0.25×10<6>、0.5×10<6>、1×10<6>、2×10<6>和4×10<6>/ml五个接种密度组，并以培养液作为空白对照组，体外构建组织工程骨，完全随机化植入双侧桡骨中段节段性骨缺损动物模型。术后进行大体观察，并在第2、4、8和12周拍前肢侧位片，观察各组的骨缺损修复情况并评分，采用统计学方法比较不同接种密度构建的组织工程骨骨缺损修复效果。 5．组织工程骨生物力学检测：术后第12周取出桡骨标本，立即在生物力学实验机上进行三点弯曲，检测最大载荷，采用统计学方法比较不同接种密度构建的组织工程骨体内成骨后的生物力学性能。 6．组织工程骨组织形态学观察：标本行HE染色，观察各组标本支架材料的吸收和骨缺损的愈合情况，比较不同接种密度构建的组织工程骨正位成骨效果。 结论: 1．密度离心法可分离得到较纯的兔MSCs，并可以诱导分化为成骨细胞。传代培养使兔MSCs体外增殖和成骨分化能力逐渐下降，兔的第4代MSCs优于其它培养代数的MSCs，可同时满足种子细胞“质”和“量”的要求。 2．同种异体兔MSCs可用作骨组织工程的种子细胞，复合MSCs的组织工程骨较单纯的同种异体骨能取得更好的骨缺损修复效果，2×10<6>/ml接种密度实验组构建的组织工程骨其骨缺损修复效果优于其它接种密度实验组。