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肾小球硬化(glomerula sclerosis,GS)是各种原因引起的肾小球损伤晚期的共同结局,是多种慢性肾脏疾病进行性肾功能丧失的最后通路,肾小球硬化的程度预示着肾功能受损的程度,决定慢性肾脏疾病患者的预后,因此对肾小球硬化发生、发展的机制及其防治越来越受到国内外学者的关注。肾小球硬化的特点为系膜细胞的异常增殖和细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)过度积聚,导致肾单位结构和功能的破坏,肾小球滤过率的持续性下降,最终出现肾衰竭。肾小球硬化的形成是一个缓慢的动态过程,涉及到细胞、细胞因子、ECM等因素之间的相互作用,最后以大量ECM在肾小球内沉积为结局。目前对肾小球硬化发病过程中ECM合成增加的研究文献较多,从形态学来看,肾小球硬化是ECM的降解平衡失调,过度积聚而致。ECM对细胞的生理功能起着非常重要的作用,它不仅是细胞粘附及支持所必需的物质,而且直接影响细胞的营养、代谢、增殖、分化和迁移,许多细胞因子通过ECM对细胞的生长、增殖和分化起着调控作用。目前已公认转化生长因子-β(TGF-β)是肾小球硬化的关键介质。根据导师李建民教授提出的中医“肾络瘀痹”是慢性肾脏疾病进展的关键因素的理论假说,选用导师治疗慢性肾衰竭的临床系列经验方“通络保肾复方”(Compound Tongluo Baoshen Prescription,CTLBSP)进行防治肾小球硬化的系列实验研究,通络保肾复方由女贞子、太子参、丹参、大黄、水蛭、川芎、牛膝、三七八味中药组成,全方具有补肾祛邪、活血通络之功效。本文开展系列研究,旨在探讨该方防治肾小球硬化的作用机制。1目的本实验进一步采用改进的血清药理学方法将通络保肾复方给予大鼠灌胃后取其血清作为药源,添加外源性脂多糖(LPS)作为刺激物进行研究,探讨通络保肾复方对培养的大鼠肾小球系膜细胞表达TGF-β、FN和LN影响,以期为中医药临床防治肾小球硬化提供科学实验依据。2方法2.1选用大鼠肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells,GMCs),通过LPS刺激后,给予大鼠通络保肾复方含药血清干预,采用MTT法检测12h,24h,48h和60h时GMCs的增殖影响。2.2通过LPS刺激大鼠GMCs,给予大鼠的含药血清干预后,进行系膜细胞爬片和胞浆蛋白的提取,用细胞免疫组化法检测大鼠肾小球系膜细胞TGF-β蛋白的表达,用western-blot检测TGF-β的蛋白含量,用细胞Elisa方法检测培养大鼠肾小球系膜细胞上清液中纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)的蛋白表达。3结果3.1 MTT:LPS刺激后12h、24h、48h及60h各时相点GMCs明显增殖,与各组比较差异显著(p＜0.05)。缬沙坦和通络保肾复方对LPS诱导的GMCs增殖具有不同程度的抑制作用,其起效时间均为12h(与LPS组相比,p＜0.05),通络保肾复方最佳抑制时间为第4 8h,以通络保肾大剂量组效果最佳。3.2Western blot:LPS刺激48h后,LPS组蛋白条带颜色明显较空白组深,说明LPS组CMCs胞浆内TGF-β蛋白明显增多,与空白组比较差异显著(p＜0.05)。缬沙坦和通络保肾复方组蛋白条带颜色减弱,与LPS组相比差异显著(p＜0.05),说明通络保肾复方可以下调TGF-β蛋白的表达,且有剂量依赖关系,与缬沙坦组比较无差异(p＞0.05)。细胞免疫组化:LPS刺激48h后,LPS组蛋白条带颜色明显较空白组深,说明LPS组GMCs胞浆内TGF-β蛋白明显增多,与空白组比较差异显著(p＜0.05)。缬沙坦和通络保肾复方组蛋白条带颜色减弱,与LPS组相比差异显著(p＜0.05),说明通络保肾复方可以下调TGF-β蛋白的表达,且有剂量依赖关系,与缬沙坦组比较无差异(p＞0.05)。3.3细胞Elisa:12h、24h、48h及60h 4个实验点不同剂量通络保肾对培养肾小球系膜细胞上清液分泌FN、LN均有抑制作用,缬沙坦和通络保肾起效时间均为12h(与LPS组相比P＜0.05),通络保肾最佳抑制时间为第48h,通络保肾复方大剂量组效果最佳,并呈剂量依赖关系。4结论4.1通络保肾复方药物血清能够抑制LPS刺激的GMCs的增殖,从而延缓肾小球硬化时的肾脏病理损伤。4.2通络保肾复方通过抑制LPS诱导的GMCs分泌TGF-β,从而抑制细胞外基质的异常沉积。4.3通络保肾复方下调肾组织FN和LN的表达,降低肾小球中FN、LN的堆聚,以上可能是通络保肾复方延缓肾小球硬化的重要作用机制。