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血清4型禽腺病毒（FAdV-4）是家禽心包积液-肝炎综合征（HHS）的病原体,自2015年以来该病在我国鸡群暴发流行,主要感染3～6周龄肉鸡,发病快,病死率高,给养禽业造成巨大的经济损失。本研究针对FAdV-4非结构蛋白和结构蛋白进行原核表达,并以重组蛋白作为诊断抗原,建立排查FAdV-4感染和评估FAdV-4灭活苗免疫抗体效价的间接ELISA检测方法。根据Gen Bank中FAdV-4非结构蛋白（100K、22K）和结构蛋白（Fiber-1、Fiber-2、Penton）的基因序列,分别设计筛选出特异性引物共5对,PCR扩增的产物连接至p ET-32a表达载体,成功构建FAdV-4的5种重组质粒:p ET-32a-100K、p ET-32a-22K、p ET-32a-Fiber-1、p ET-32a-Fiber-2和p ET-32a-Penton;转入BL（21）DE3感受态细胞后,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,结果显示这5种重组蛋白均得到良好表达,其中p ET-32a-Fiber-1、p ET-32a-Fiber-2和p ET-32a-100K重组蛋白为包涵体表达,p ET-32a-Penton和p ET-32a-22K重组蛋白为可溶性表达;用镍柱亲和层析纯化后,经SDS-PAGE分析显示纯化后的5种重组蛋白均得到单一的特异性条带,纯化效果较好;Western-blot结果显示5种重组蛋白均能与FAdV-4感染的阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性,为进一步开发FAdV-4的ELISA诊断试剂盒提供有效抗原。分别以FAdV-4非结构蛋白的重组蛋白p ET-32a-100K和p ET-32a-22K作为包被抗原,优化反应条件,建立检测FAdV-4感染产生抗体的两种间接ELISA方法:100K-ELISA和22K-ELISA。结果显示,两种方法最佳抗原包被浓度分别为6μg/m L和16μg/m L;一抗血清和酶标二抗最佳稀释度分别为1:100和1:5000,最佳孵育时间均为30 min。两种方法不与其他禽病的阳性血清发生交叉反应,特异性良好;FAdV-4感染鸡阳性血清稀释640倍仍可以用100K-ELISA和22K-ELISA方法检测到,灵敏度较高;两种方法批内最大变异系数为4.7%,批间最大变异系数为4.9%,均小于5%,重复性良好。用两种方法分别检测FAdV-4人工感染SPF鸡血清样品50份,结果均为阳性;检测灭活苗免疫SPF鸡血清样品50份,结果均为阴性,表明这两种方法可鉴别FAdV-4灭活苗免疫和自然感染鸡的抗体。分别以FAdV-4结构蛋白的重组蛋白p ET-32a-Fiber-1、p ET-32a-Fiber-2和p ET-32a-Penton作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立3种检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法:Fiber-1-ELISA、Fiber-2-ELISA和Penton-ELISA。结果显示,三种方法最佳抗原包被浓度分别为4μg/m L、2.5μg/m L和2μg/m L,一抗血清最佳稀释度分别为1:200、1:400和1:400;酶标二抗最佳稀释度均为1:10000。三种方法均不与其他禽病的阳性血清发生交叉反应,特异性良好;FAdV-4阳性血清以1:1600稀释后仍能用3种方法检测到,敏感性良好;三种方法批内和批间最大变异系数均小于5%,重复性良好;用3种方法检测实验室FAdV-4人工感染SPF鸡血清样品和灭活苗免疫鸡血清样品各50份,均为阳性。采集鸡场FAdV-4灭活苗免疫和非免疫鸡血清分别96份和217份,用100K-ELISA、22K-ELISA、Fiber-1-ELISA、Fiber-2-ELISA和Penton-ELISA五种方法检测,对灭活苗免疫的鸡血清样品的检测阳性率分别为3.1%、5.2%、93.8%、100.0%和94.8%,对非免疫鸡血清样品的检测阳性率分别为30.9%、27.6%、35.5%、39.1%和42.3%。表明非结构蛋白100K-ELISA和22K-ELISA方法可以区分FAdV-4灭活苗免疫和自然感染产生的抗体,检出的阳性鸡即为FAdV-4感染;结构蛋白Fiber-1-ELISA、Fiber-2-ELISA和Penton-ELISA方法对FAdV-4灭活苗免疫和自然感染产生的抗体均可检测出,可用于FAdV-4灭活苗免疫抗体效价的评估。本研究利用原核表达技术,成功表达FAdV-4的5种重组蛋白:p ET-32a-100K、p ET-32a-22K、p ET-32a-Fiber-1、p ET-32a-Fiber-2和p ET-32a-Penton,可作为诊断的抗原。以FAdV-4非结构蛋白p ET-32a-100K和p ET-32a-22K重组蛋白作为包被抗原,建立2种区分FAdV-4灭活苗免疫和自然感染产生抗体的间接ELISA检测方法,为排查和净化FAdV-4提供技术支持;以FAdV-4结构蛋白p ET-32a-Fiber-1、p ET-32a-Fiber-2和p ET-32a-Penton重组蛋白作为包被抗原,建立3种检测FAdV-4抗体的ELISA方法,为FAdV-4抗体效价评估提供有效方法。