研究背景和目的结直肠癌是我国第4位最常见的恶性肿瘤,发病率呈现出逐年上升和逐渐年轻化的趋势,而导致结直肠癌患者死亡的主要原因则是肿瘤的转移。肿瘤转移是一个复杂的、多步骤的、多阶段的过程,每个阶段都受多种基因或者蛋白的调节,其中最重要的改变就是肿瘤细胞运动行为和运动能力的增强,这也是是其侵袭和转移必不可少的。腹膜转移是结直肠癌比较常见的转移方式,有文献报道约13%的结直肠癌患者会发生腹膜转移,在首次手术时发现有腹膜转移的几率大约有7%,另有4%-19%的结直肠癌患者在根治术后也会出现腹膜转移。腹膜转移的发生使结直肠癌患者预后很差,只有5-9个月的中位生存期,因此,筛查结直肠癌腹膜转移相关的生物学标记物不仅对早期诊断及判断预后具有重要意义,而且有利于阐明结直肠癌转移的分子机理,还能为临床诊治、药物筛选及预后判断提供新的靶点。随着人类基因组计划(Human genome project)的实施和分子生物学有关学科的迅猛发展,越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定,基因序列数据正在飞速的迅速增长。基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)技术就是顺应这一科学发展要求的产物。基因芯片由于其具有高速度、高通量、集约化和低成本的特点,被广泛用于胰腺癌卵巢癌、乳腺癌、胃癌以及结直肠癌等不同癌组织差异表达基因的筛查。同样,在结直肠癌原发灶和肝脏、淋巴结转移灶之间也存在着大量差异表达的基因,但腹膜转移组织和原发肿瘤组织中有哪些基因存在表达差异,国内外报道甚少。因此,借助于基因芯片技术比较结直肠癌原发肿瘤组织与腹膜转移组织全基因组mRNA表达水平的差异,就可以找到结直肠癌腹膜转移相关的基因。为此,我们采用基因芯片技术比较4对结直肠腺癌原发肿瘤组织和与之配对的腹膜转移组织全基因组表达水平的差异,通过倍数法确定差异表达的基因,并对这组基因进行功能注释聚类分析。我们通过对肿瘤进展相关的功能类中基因的分析,探讨结直肠癌腹膜转移的分子机制。由于基因芯片技术有一定的假阳性率,因此我们对部分基因芯片技术筛选出的差异表达基因进行RT-PCR验证。根据以上实验结果,我们最终确定胶原三股螺旋重复蛋白1(Collagen Triple Helix Repeat Containing1, CTHRC1)可能与结直肠癌腹膜种植转移相关,作为下一步试验的目的基因。CTHRC1最早是在筛查大鼠球囊损伤动脉和正常动脉之间差异基因的时候发现的,在大鼠成纤维细胞随着CTHRC1表达量的提高运动能力也相应提高。在许多人类实体癌中也有CTHRC1高表达的报道。最近在有一些研究也主要集中在CTHRC1和消化道肿瘤之间的关系,比如食管癌、胃癌和肠癌等。CTHRC1是wnt蛋白的辅助因子,他能通过稳定wnt蛋白与他在胞膜上受体的结合从而发挥选择性激活wnt/pcp通路的作用。Wnt/pcp通路的激活使得他的下游小鸟苷三磷酸酶(small GTPases)的活性增强,尤其是Rac1和RhoA。Ras GTPases超家族包含了Rho GTPases亚群,在所有的RhoGTPases中,对Rac1(Ras-related C3botulinum toxin substrate), Cdc42(cell division cycle42) and RhoA (Ras homolo-gous member A)的研究最为广泛。Rac1的激活主要促进癌细胞的迁移和浸润,RhoA的激活主要降低癌细胞间粘附能力,促进癌细胞的迁移和转移。MiRNAs是广泛存在的,大小约21～25个碱基的非编码微小RNA,他们通过与目的基因的信使RNA3’非翻译区结合而抑制基因表达来发挥作用。MiRNAs与目的基因的信使RNA3’非翻译区的相互作用可以导致目的基因信使RNA翻译被抑制或者降解。已有大量文献报道niRNA在人类癌症中有异常表达,miRNA通过靶定促癌或者抑癌基因,发挥着类似肿瘤抑制因子或者促癌因子的作用。另有研究进一步证明miRNA与肿瘤的侵袭、转移也有关系,这一发现为肿瘤转移的诊断和治疗提供了新的切入点。目前关于miR-520家族的的研究并不是很多,对其主要主要研究成果集中在了乳腺癌。有文献指出miR-520d在乳腺癌中与HER2/nue受体有相互作用的关系。还有文献指出miR-520c在乳腺癌中由于可以调控TGF-β和NF-κB通路,在乳腺癌的发展过程中起到一个抑癌基因的作用。在其他癌症组织中尚未发现有关miR-520d的报道。因此本文的研究目的是明确CTHRC1在结直肠癌中的表达特性,探讨CTHRC1促进结直肠癌转移的机制,初步探讨对miR-520d与CTHRC1在结直肠癌中关系。研究方法及结果(一)基因芯片筛查差异表达基因2009年6月到2010年4月在中国广州南方医科大学附属南方医院手术治疗结直肠腺癌伴腹膜种植转移病人4例,术中收集原发肿瘤组织和腹膜转移组织标本,浸泡于于RNA Later中常温保存。应用Trizol法提取总mRNA,经逆转录合成cDNA后经体外扩增合成aRNA后用Cy3荧光分子标记,标记后与人类全基因组表达谱芯片杂交,待芯片完全干燥后,利用扫描仪(LuxScan3.0,北京博奥)进行扫描,扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号(GenePix Pro6.0),随后进行数据分析和处理。采用倍数法(≥2或≤0.5)确定配对标本间差异表达基因,通过DAVID (The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)分析工具对这组差异表达基因进行基因功能的注释和基因富集分析,筛选出与肿瘤进展相关的功能类,在这些功能类中挑选差异倍数较高且参与多个功能类的基因进行半定量荧光RT-PCR验证。根据试验结果及文献报道最后决定将胶原三股螺旋重叠蛋白1(collagen triple helix repeat containing1, CTHRC1)作为继续研究的对象。(二)基因CTHRC1生物学功能的初步探讨1.基因CTHRC1对结直肠癌细胞生物功能的影响1.1Western Blot检测SW480, SW620, HCT116, LS174, HT29,和LOVO这6种人结直肠癌细胞株中CTHRC1的蛋白表达含量。以GAPDH为内参照物,将Western Blot的结果照片用Gelpro32软件进行分析,以条带的光密度值(IOD)作为对应条带的表达量。将目的条带和内参照的光密度值比较出来的倍数值用单因素方差分析进行统计。结果显示在这6组细胞中CTHRC1蛋白表达量差异具有统计学意义(P<0.001)。最高的是HCT116,9.2127±0.486,最低的是SW480,1.455±0.21。因为SW480(1.455±0.21)和SW620(5.224±0.053)具有相似的遗传背景而且转移潜能不相同,选这两株细胞作为作为下一步试验的细胞。1.2免疫印迹检测CTHRC1转染效率将GV287空载体(对照组,NC)和GV287-CTHRC1重组载体分别转染SW480, SW620细胞,Western Blot检测发现稳定转染CTHRC1基因后的SW480, SW620细胞中CTHRC1的蛋白表达较对照组升高。1.3CTHRC1对结直肠癌细胞生物学特性的影响1.3.1CCK-8法观察在过表达CTHRC1之后细胞增殖速度明显下降：SW480细胞CTHRC1过表达组和对照组细胞增殖数具有统计学意义的差异出现在第四天(P=0.001),增殖和时间的交互效应具有统计学差异(F=16.528,P<0.001),过表达组和对照组组内细胞增殖能力组间差异具有显著性(P<0.001)；SW620过表达组和对照组的统计学差异出现在第3天(P=0.004)细胞生长时间水平差异具有显著性(F=2529.379,P<0.001),增殖和时间的交互效应具有统计学差异(F=26.086,P<0.001),过表达组和对照组组内细胞增殖能力组间差异具有显著性(P<0.001)1.3.2克隆形成实验显示：在过表达CTHRC1之后细胞平均克隆形成率下降,SW480细胞组间差异具有统计学意义(P<0.001)；SW620细胞组间差异具有统计学意义(P=0.001)。1.3.3细胞体外侵袭实验：SW480、SW620细胞CTHRC1过表达组和对照组组间迁移能力差异具有统计学意义(P<0.001; P<0.001); SW480、SW620细胞时间与细胞组间交互效应差异有统计学意义(F=69.452, P<0.001; F=117.365, P<0.001).两组细胞间同一天测得数据经单因素方差分析SW480、SW620均在第二天开始有统计学差异(P<0.001,P<0.001)。1.3.4划痕试验检测细胞迁移能力：SW480细胞CTHRC1过表达组划痕愈合能力强于对照组(P=0.041)。2.基因CTHRC1在结直肠癌组织中的表达及临床意义2.1收集2003年1月～2009年6月间广州南方医院普外科行手术治疗的结直肠腺癌伴腹膜转移病人的组织蜡块,肿瘤原发组织蜡块标本57块,腹膜转移组织蜡块标本30块,另外从数据库中选取5年随访期内无腹膜转移发生的病人原发肿瘤蜡块标本54块,作为对照组。免疫组化方法验证CTHRC1在结直肠癌蜡块组织中的表达,用平均光密度值代表CTHRC1蛋白表达强度。2.2CTHRC1主要在胞浆内表达,伴有腹膜转移的原发癌组、腹膜转移组和不伴有腹膜转移的原发组组蛋白表达量分别是0.25±0.04,0.26±0.04和0.19±0.03,组间差异具有统计学意义(P<0.001),而且伴有腹膜转移的原发癌组、腹膜转移组的蛋白表达量均高于不伴有腹膜转移的原发组(both P<0.001)。2.3根据CTHRC1表达的平均值0.224,我们将所有纳入课题的患者分为CTHRC1高表达组和低表达组。高表达组患者的生存时间为31.36±5.63个月,而低表达组的生存时间为57.84±3.69个月,两组的生存时间差异具有统计学意义(P<0.001)。2.4Cox回归分析显示同性别、肿瘤浸润深度、肿瘤大小和淋巴结转移一样,CTHRC1的表达水平也是一个影响患者生存独立因素,而且CTHRC1高表达组死亡的风险是低表达组的2.754倍(P<0.001,95%CI1.731to4.383)。(三)基因CTHRC1与hsa-mir-520d关系的初步探讨1.CTHRC1与hsa-mir-520d靶向关系的初步预测。1.1以CTHRC1为检索词在miRDB、miRanda、miRWalk、TargetScan四个预测网站发现共同交集hsa-mir-520d。并预测出hsa-mir-520d与CTHRC13’UTR区有结合位点。1.2RT-PCR法检测Mir-520D-5P在四种不同结直肠癌细胞株中的表达。其中SW480细胞的表达量最高178.493±±±7.867,SW620为7.09±2.73,P<0.001,与CTHRC1蛋白表达水平呈负相关关系。2. CTHRC1与mir-520D-5P相关性分析2.1RT-PCR法检测23对结直肠癌配对组织中mir-520d-5P表达情况。结果显示癌旁、正常组织中mir-520D-5P的表达量明显高于配对癌组织中mir-520d-5P的表达,且差异存在显著性(P=0.001)2.2Western blot检测23对结直肠癌配对组织中CTHRC1蛋白水平表达情况Western blot检测23对结直肠癌组织中CTHRC1的蛋白表达水平,用Geopro32软件对Western blot结果图片进行分析,用灰度值代表蛋白表达的数值,GAPDH为内参照。用CTHRC1的灰度值比GAPDH的灰度值代表蛋白表达的强弱,用配对样本t检验检测可知,癌组织中CTHRC1的表达量明显高于配对的正常组织中CTHRC1的表达,数值分别是1.3018±1.016,0.6567±0.552且差异存在具有统计学意义(P=0.003)。由以上结果可推测在组织水平上CTHRC1与mir-520D-5P是负相关的关系。2.3miR-520d-5p对结直肠癌细胞中CTHRC1蛋白表达水平变化的影响2.3.1结直肠癌细胞SW480瞬时转染mimics和inhibitor后,niR-520D-5P在细胞水平上的变化miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs,运用化学合成的方法合成,能增强内源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。SW480细胞瞬时转染mimics和inhibitor24h后检测发现,mimics组miR-520D-5P的表达量为161.167±16.06而对应的NC组为19.456±3.53,两组间差异有统计学意义(P<0.001)。而inhibitor组比对应NC组正相反,NC组miR-520D-5P的表达量要高于inhibitor组,差异具有统计学意义(P=0.002)2.3.2结直肠癌细胞瞬时转染后CTHRC1蛋白水平表达变化转染SW480细胞48h以后检测CTHRC1蛋白表达变化发现,miR-520D-5P mimics发挥了模拟生物体内源性miRNA的作用,使CTHRC1蛋白表达下调,而inhibitor则发挥了沉默miR-520d-5p的作用,使CTHRC1蛋白表达上升。结论1.基因CTHRC1是结直肠癌腹膜转移相关基因。2.基因CTHRC1的高表达与腹膜转移有关而且预示患者预后不佳。3.基因CTHRC1能抑制结直肠癌细胞的增殖却又可以促进癌细胞的迁移。4. miR-520d-5p与基因CTHRC1可能由相互调控的关系。