忧遁草叶提取物对去卵巢大鼠骨质疏松的作用研究

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骨质疏松是一种以低骨量和高骨折风险为特征的疾病。由于其发病率较高、治疗周期较长,给患者和社会带来了巨大的经济负担,且常见的抗骨质疏松药物副作用较大。因此,寻找安全高效的天然植物及其功能性组分改善骨质疏松已成为当前重要的研究方向。忧遁草(Clinacanthus nutans)作为一种药食同源植物,有治疗骨折、跌打肿痛等作用,其富含的黄酮类、皂苷类和多糖类等活性成分具有改善骨质疏松的潜在作用。鉴于此,本文首先在体内探究忧遁草叶粗提物对骨质疏松大鼠的影响作用;随后,对粗提物中的黄酮类、皂苷类和多糖类进行分离纯化,并筛选出影响骨代谢作用的主要物质。进一步,体外利用成骨细胞,对筛选出的皂苷类物质影响成骨功能的分子机制进行探究。最后,优化忧遁草总皂苷的提取工艺。为忧遁草叶在改善骨质疏松方面的药理作用提供理论依据。论文主要研究内容和结果如下:首先,对成年雌性大鼠切除卵巢,诱导建立骨质疏松模型,探究忧遁草叶醇提物与水提物对骨质疏松的作用。结果表明,与模型组相比,忧遁草叶醇提物和水提物均能够显著提高去卵巢大鼠的骨密度和骨生物力学强度,提高骨小梁参数中骨体积、骨组织比例、骨面积、分割面体比例、小梁厚度、连接密度和降低小梁间隙来改善骨组织微结构,显著降低血清中骨碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、I型胶原羧基末端肽水平,提高I型前胶原氨基端肽和骨钙素水平。说明忧遁草叶粗提物对骨质疏松有较好的改善作用。其次,对忧遁草叶醇提物中的黄酮类、皂苷类和水提物中的多糖类三种活性成分进行分离纯化,探究其对去卵巢大鼠骨质疏松的作用。结果表明,分离得到黄酮类物质的含量为80 mg/100 mg,含有5种碳苷黄酮和1种氧苷黄酮;皂苷类物质的含量为71 mg/100 mg,含有5种三萜皂苷;粗多糖的含量为60 mg/100 mg,有8种单糖组成。体内研究结果表明,三种活性物质均可以降低骨质疏松大鼠血清白介素-6、肿瘤坏死因子-α、丙二醛的水平,提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的水平,提高骨密度和骨极限负荷,恢复骨小梁部分网状结构和逆转血清中骨转换指标的异常变化。说明忧遁草黄酮类、皂苷类和多糖类物质可以通过抑制绝经后骨质疏松大鼠炎症反应和氧化应激,降低炎症因子和氧化应激标志物的分泌,调节骨代谢,达到改善骨质疏松的作用。其中,皂苷类物质改善作用最为显著。然后,探究忧遁草皂苷对成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化、矿化及成骨相关基因m RNA表达量的影响。通过细胞增殖实验、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性检测、茜素红染色以及RT-q PCR等方法,探究皂苷对MC3T3-E1的作用以及成骨相关基因m RNA的表达量的影响。结果表明,皂苷溶液对细胞无毒性作用,在500、1000?g/m L的浓度下,能够显著促进细胞增殖。不同浓度的皂苷溶液诱导处理细胞3 d、6 d、9 d后,均可以显著提高成骨细胞分化ALP的能力。皂苷对细胞诱导分化处理14d后,其矿化结节数目明显多于对照组。忧遁草皂苷可通过调控OPG/RANKL、Wnt/β-catenin信号通路对骨形成过程和骨吸收过程产生影响。最后,对忧遁草总皂苷的提取工艺进行优化。通过单因素和响应面法确定超声辅助提取忧遁草总皂苷的工艺参数为:乙醇体积分数92%,料液比1:44(g/m L),提取时间0.6 h,提取温度66℃。此条件下,忧遁草总皂苷的提取得率最高,为2.30%。综上,忧遁草叶提取物具有改善骨质疏松的潜在作用,其中皂苷类物质的改善效果最显著,且能够改善成骨细胞的功能,但皂苷中的单体成分对骨质疏松的影响及作用机制还有待进一步研究。
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