论文部分内容阅读
目的:牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是存在于牙髓组织中的未分化或低分化的成体干细胞,具有一定的增殖能力和分化潜能,在一定条件下,可分化为成骨细胞、成牙本质细胞样细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。临床上深龋、磨损等慢性损伤诱导DPSCs迁移至损伤部位,分化成为成牙本质细胞样细胞,产生修复性牙本质以保护牙髓。组蛋白甲基化调控的表观遗传修饰在调控成骨分化方面起着重要作用,含十字形结构域蛋白-3(Jumonji domain-containing3,Jmjd3),是一种高度特异性的组蛋白去甲基化酶,主要功能是使组蛋白H3第27位赖氨酸残基(H3K27)脱甲基以激活基因转录。大量研究表明,Jmjd3调节多种细胞的成骨分化,但对Jmjd3是否参与DPSCs的成牙本质向分化了解甚少。NF-κB(Nuclear Factor-kappa B)是一种普遍存在的转录因子,广泛参与免疫、炎症、肿瘤、分化等生理病理过程。研究发现,NF-κB在炎症、肿瘤、创伤中可以诱导Jmjd3的表达,但其在分化中是否能调节Jmjd3的表达尚无报道。本研究以DPSCs为主要研究对象,检测Jmjd3在DPSCs向成牙本质细胞样细胞分化过程中的表达变化,探讨Jmjd3调控的表观遗传修饰在DPSCs的成牙本质向分化过程中所起的作用,检测NF-κB信号通路对Jmjd3的表达以及DPSCs成牙本质向分化的影响,以期为临床护髓治疗提供理论和实验依据。材料与方法:一、实验方法1、原代分离培养DPSCs取得伦理委员会批准及患者知情同意后,收集因阻生或正畸减数拔除的健康完整恒牙,用组织块酶消化法从人牙髓组织中分离提取DPSCs。2、采用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞表面标记物表达情况。3、体外诱导DPSCs向成骨细胞分化21d,采用茜素红染色(Alizarin red staining)检测细胞矿化水平。4、体外诱导DPSCs向神经元分化14d,采用免疫荧光染色法(Immunofluorescence staining)检测β-tubulinⅢ蛋白的表达。5、体外诱导DPSCs向成牙本质细胞样细胞分化7d,采用ALP染色(ALP staining)检测ALP表达情况。6、体外诱导DPSCs向成牙本质细胞样细胞分化不同时间(0、3、5、7、14d),采用定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测Jmjd3及成牙本质标志基因DSPP、DMP1的mRNA表达变化,采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测Jmjd3的蛋白表达变化。7、在成牙本质分化诱导液中加入不同浓度(0、1、10μmol/L)的Jmjd3活性抑制剂GSK-J4共同处理细胞7、14d,采用qPCR方法检测DSPP、DMP1的mRNA表达变化;处理细胞21d,采用茜素红染色法检测细胞矿化水平的变化。8、DPSCs成牙本质分化诱导0、5、15、30、60、120、240min,采用蛋白质印迹法检测NF-κB p-p65和总NF-κB p65的蛋白表达变化;用含有10μmol/L BAY 11-7082的成牙本质分化诱导液处理细胞30min,采用蛋白质印迹法检测NF-κB p-p65和总NF-κB p65的蛋白表达变化。9、用含有10μmol/L BAY 11-7082的成牙本质分化诱导液作用于细胞7d,采用qPCR方法检测Jmjd3、DSPP、DMP1的m RNA表达变化。10、si RNA转染DPSCs,建立对照组(NC)和实验组(si NF-κB p65),成牙本质分化诱导7d,采用qPCR方法检测Jmjd3、DMP1、ALP的mRNA表达变化。二、统计方法每组实验至少重复3次,应用SPSS 18.0软件包对实验数据进行单因素方差分析,多组间比较采用Dunnett t检验,以p<0.05为差异有统计学意义。结果:1、本研究所提取的细胞呈梭形,似成纤维细胞;阳性表达间充质干细胞表面标记物CD29、CD44、CD105、CD146,而不表达造血干细胞表面标记物CD34、CD45;在适当的诱导条件下,可以向成骨细胞、神经元细胞分化。2、DPSCs在成牙本质分化诱导液中培养0、3、5、7、14d,随着分化时间的延长,Jmjd3及成牙本质标志基因DSPP、DMP1的mRNA表达升高(p﹤0.05),Jmjd3的蛋白表达水平也升高,ALP染色阳性。3、在成牙本质分化诱导液中加入不同浓度(0、1、10μmol/L)的Jmjd3活性抑制剂GSK-J4共同处理DPSCs不同时间,当1μmol/L GSK-J4处理14d,DSPP的mRNA表达下降(p﹤0.05);当10μmol/L GSK-J4处理7或14d,DSPP、DMP1的mRNA表达均明显下降(p﹤0.05);当10μmol/L GSK-J4处理21d,茜素红染色明显变浅。4、DPSCs在成牙本质分化诱导液中培养0、5、15、30、60、120、240min,NF-κB p-p65表达从5min开始升高,到30min达最高,含10μmol/L BAY 11-7082的成牙本质分化诱导液处理细胞30min,NF-κB p-p65表达下降。而总NF-κB p65的表达无明显变化。含10μmol/L BAY 11-7082的成牙本质分化诱导液作用于细胞7d后,Jmjd3、DSPP、DMP1的mRNA表达上调(p﹤0.05)。NF-κB p65 siRNA转染至DPSCs后分化诱导7d,Jmjd3、DMP1、ALP的mRNA表达上调(p﹤0.05)。结论:Jmjd3参与DPSCs向成牙本质细胞样细胞分化的调控,可能依赖其去甲基化酶活性正向调控分化过程;抑制NF-κB信号通路可以上调Jmjd3的表达以及促进DPSCs的成牙本质向分化。