【摘 要】
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牛卵泡发育及排卵受多种因素影响,既有生长因子的参与,如转化生长因子（Transforming Growth Factor,TGF）、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子等,又涉及激素的调控,如促卵泡激素（Follicle-Stimulating Hormone,FSH）、雌激素（Estrogen,E2）、胰岛素等。牛是单胎动物,在一个发情周期中通常只有一个卵泡生长发育较快并成为优势卵
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（No.31873002）； 山西省重点研发计划（一般）农业项目（No.201703D221020-1）； 山西省重点研发计划（社会发展）项目（No.201803D31062）；
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牛卵泡发育及排卵受多种因素影响,既有生长因子的参与,如转化生长因子（Transforming Growth Factor,TGF）、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子等,又涉及激素的调控,如促卵泡激素（Follicle-Stimulating Hormone,FSH）、雌激素（Estrogen,E2）、胰岛素等。牛是单胎动物,在一个发情周期中通常只有一个卵泡生长发育较快并成为优势卵泡（Dominant Follicle,DF）,其它卵泡即为从属卵泡（Subordinate Follicles,SF）,SF最终走向闭锁而不能排卵。探究牛卵泡闭锁机理对发情期超数排卵、体外受精、胚胎移植技术应用和优良种畜扩繁具有重要意义。可卡因-苯丙胺调节转录肽（Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript Peptide,CART）是下丘脑分泌的神经肽,属于经典类激素,其通过结合靶细胞膜上的受体,抑制颗粒细胞（Granulosa Cells,GCs）增殖和E2分泌,从而对牛卵泡起负调控作用。基于CART在牛卵泡发育过程中的重要作用,本研究旨在通过生物膜干涉（Biolayer Interferometry,BLI）、生物信息学分析、免疫亲和层析、细胞体外培养等技术筛选及鉴定CART受体。本研究以健康的西门塔尔牛为试验对象,内容及结果如下:1.收集卵泡并获取GCs膜碎片,合成生物素标记的CART活性肽并固定于链霉亲和素传感器（SA传感器）,分子互作分析仪实时检测CART与GCs膜碎片的结合过程,结合信号显示GCs膜上存在CART受体。2.运用免疫亲和层析及Label-free蛋白质组学技术,共检测到620种蛋白与CART互作,其中,12种蛋白可能影响牛卵泡发育;生物信息学软件预测蛋白亚细胞定位及膜蛋白跨膜次数,获得7个7次跨膜蛋白;利用生物信息学软件分析7次跨膜蛋白N端位置、亲水性、疏水性及结合位点,最终将符合CART受体结构特征的ZMPSTE24作为CART候选受体。3.通过Discovery Studio 2019软件进行同源建模及蛋白对接,分析优化后复合物结构及作用模式,明确了ZMPSTE24与CART存在相互作用位点。4.通过RNA干扰（RNA Interference,RNAi）技术、Cell Counting Kit-8（CCK-8 Kit）和ELISA法对CART候选受体进行功能研究,分别沉默CART候选受体后,CART仍抑制GCs增殖及E2分泌,表明CART候选受体未参与CART抑制牛卵泡发育的信号传导过程,ZMPSTE24、TEDDM1、CMKLR1、AGTR2是否为CART受体有待进一步研究。
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