背景:周围神经损伤是临床常见病,常导致患者运动及感觉等肢体功能障碍,严重影响患者日常活动表现、阻碍活动参与,致生活质量下降的同时亦增加社会负担。如何促进其功能恢复一直是临床亟待解决的重点问题。振动治疗现已被证实具有能够提高肢体肌力,促进神经功能恢复等作用,但应用振动刺激治疗疾病时所采用的振动参数不尽相同,且无选择依据。本课题组基于前期研究发现振动治疗时频率是产生效果的关键因素之一,每个生物体都是一个弹性体,振动时可看成弹簧-质量-阻尼系统,各组织器官都有它的固有频率存在。因此,本实验将以测得的固有频率为基础设定小于、等于、大于固有频率的振动参数,并将其应用于坐骨神经钳夹伤大鼠模型作局部振动治疗,利用行为学、电生理、组织形态学等方法观察大鼠神经功能恢复情况,并通过免疫组织化学方法探究其对周围神经损伤后肢体功能恢复的潜在效应途径,为振动治疗促进周围神经损伤功能恢复提供理论依据。第一部分:坐骨神经损伤后大鼠臀大肌、小腿三头肌固有频率测定目的:建立大鼠坐骨神经Ⅲ度损伤模型,并测定损伤后大鼠臀大肌、小腿三头肌固有频率,分别观察不同状态下其相同部位的固有频率是否一致,为振动治疗频率的选择提供实验依据。方法:将36只清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠,随机分为正常组(n=14)、模型组(n=14)、麻醉组(n=8)进行固有频率测定。模型组行坐骨神经钳夹伤模型。麻醉组处以腹腔麻醉,余不做任何处理。○1模型鉴定:造模后于正常组、模型组各随机抽取6只进行SunderlandⅢ度神经损伤模型鉴定,通过运动神经传导速度及坐骨神经HE染色进行判定;○2固有频率检测:造模后第7天通过振动激励仪器对大鼠臀大肌、小腿三头肌施加冲击振动激励,在振动响应检测模块测得的数据基础上,根据实时频谱观察、时频分析方法,确定大鼠臀大肌、小腿三头肌固有频率。结果:(1)模型鉴定:电生理检测:模型组符合MNCV下降至10m/s以下,且动作电位波幅降低。HE染色:正常组:神经纤维结构完整、排列整齐,由大小不等的神经束组成,神经束外被神经束膜及外膜包绕;模型组:神经纤维断裂且排列紊乱,间质血管充血,组织结构排列疏松,神经束膜仍保持连续性。(2)三组大鼠每个受试部位存在两个规律性明显的峰值,比较结果如下:1)空白组、模型组、麻醉组大鼠臀大肌、小腿三头肌第一峰值频率无统计学差异(P>0.05);2)空白组、模型组、麻醉组大鼠臀大肌、小腿三头肌第二峰值频率无显著性差异(P>0.05)。3)臀大肌、小腿三头肌之间频率值无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)坐骨神经III度损伤模型建立成功。(2)确立大鼠臀大肌、小腿三头肌的第一峰值为其固有频率;臀大肌、小腿三头肌肌肉组织的固有频率是稳定的,同一肌肉组织的固有频率不会因其所处状态不同而发生较大差异。第二部分:局部振动治疗对大鼠坐骨神经损伤后行为学及电生理研究目的:通过动物实验的行为学及神经传导速度观察,评估不同频率的局部振动治疗对坐骨神经损伤后大鼠后肢神经连通性及功能恢复的影响。方法:将48只清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为:假手术组(n=8)、模型组(n=8)、振动治疗组(n=24)、假干预组(n=8)。假手术组仅暴露坐骨神经但不做钳夹;模型组、振动治疗组、假干预组均建立右侧坐骨神经钳夹伤模型。假手术组和模型组无特殊干预;振动治疗组分别予3Hz、8Hz、13Hz对患侧臀大肌肌腹中央位置进行振动;假干预组仅将振动器头端置于患侧臀大肌肌腹中央但不予振动。由于术后1周损伤侧肢体Catwalk步态分析各项指标均测不出,假手术组术后1周即可愈合,而本实验治疗介入于神经损伤后第7天进行,因此选择治疗后1周、2周、3周、4周行Cat Walk步态分析检测,观察大鼠最大接触平均强度、足印面积、摆动速度的变化;机械缩足反应阈值则于术前、术后7天、治疗后1周、2周、3周、4周进行检测,以评估局部振动治疗对大鼠坐骨神经损伤后行为学运动及感觉功能的影响,并于4周取材时检测大鼠神经电生理(坐骨神经传导速度),评估局部振动治疗对大鼠坐骨损伤后神经连通性的作用。结果:(1)步态分析-最大接触平均强度结果显示:3Hz组在治疗第1周时即高于13Hz组、假干预组及模型组(P<0.05),至第2周达到最大值,与8Hz、13Hz组、假干预及模型组均有差异(P<0.05),第3周保持平稳,与8Hz、13Hz组、假干预及模型组有差异(P<0.05),第4周稍有下降。8Hz组在治疗第1周高于13Hz组、假干预组及模型组(P<0.05),第2、3、4周保持平稳稍上升。13Hz组第1、2周上升幅度较小,第3、4周平稳上升。模型组与假干预组之间无显著差异(P>0.05)。至第4周,3Hz组、8Hz组、13Hz组均明显高于假干预组及模型组(P<0.05),但均未达到假手术组水平(P<0.001)。(2)步态分析-足印面积结果显示:3Hz治疗组在第1、2周呈明显上升趋势,至第2周达到最高水平,与13Hz组、假干预组及模型组有统计学差异(P<0.05),第3周仍高于假干预组、模型组(P<0.05),第3、4周呈平稳趋势。8Hz治疗组第1、2周呈上升趋势,至第2周明显高于假干预组及模型组(P<0.05),第2、3周呈稍下降趋势,第3、4周再次升高。13Hz组在第1、2周时上升趋势较3Hz组、8Hz组低,但第3、4周时呈明显上升趋势,与模型组及假干预组有统计学差异(P<0.05)。至第4周,3Hz组、8Hz组、13Hz组均高于模型组及假干预组(P<0.05),但均未达到假手术组水平(P<0.001)。(3)步态分析-摆动速度结果显示:3Hz治疗组第1、2周呈上升趋势,均高于模型组及假干预组(P<0.05),第2周时与13Hz、假干预组、模型组有统计学差异(P<0.05),第2、3周持续上升,第3、4周保持平稳。8Hz治疗组第1、2周高于模型组及假干预组(P<0.05),第2、3周持续上升,但斜率较3Hz组低,第3、4周保持平稳上升趋势。13Hz组在第1、2周时上升幅度较3Hz、8Hz组低,但高于模型组、假干预组(P<0.05),第2、3、4周呈明显上升趋势,至第4周达到最高水平。3Hz、8Hz、13Hz振动治疗虽有显著提高但均未达到假手术组水平(P<0.001)。(4)机械缩足阈值测试统计显示:术前各组大鼠基线相同,术后大鼠痛阈明显下降,各组与假手术组有明显差异(P<0.001);至治疗第1周,3Hz、8Hz、13Hz均有上升趋势,8Hz、13Hz上升趋势明显且与模型组、假干预组有统计学差异(P<0.05);治疗第1、2周,3Hz、13Hz持续上升,8Hz呈平稳趋势,均与模型组、假干预组有统计学差异(P<0.05);治疗第2、3周,3Hz、8Hz、13Hz均呈上升趋势,与模型组、假干预组有统计学差异(P<0.05),至第3周时13Hz达到最高幅度;治疗第3、4周,13Hz与8Hz均保持平稳稍有下降,而3Hz组持续上升,至第4周达到最大值,期间与模型组、假干预组有统计学差异(P<0.05)。3Hz组、8Hz组、13Hz在治疗4周均有显著提高但未达到假手术组水平(P<0.05)。(5)电生理统计显示:干预4周后,模型组、假干预组、3Hz组、8Hz组、13Hz组运动神经传导速度(MNCV)显著低于假手术组(P<0.001);3Hz组、8Hz组、13Hz组MNCV显著高于模型组、假干预组(P<0.05);3Hz、8Hz、13Hz之间虽无显著性差异(P>0.05),但3Hz组稍高于8Hz、13Hz组。结论:不同频率局部振动治疗均可提高坐骨神经钳夹伤大鼠步态分析参数最大接触平均压力、足印面积、摆动速度,缓解坐骨神经钳夹伤后大鼠痛觉敏感,提高坐骨神经传导速度,且3Hz优于8Hz及13Hz。第三部分局部振动治疗对坐骨神经损伤大鼠组织形态学及神经相关因子免疫组化研究目的:通过电镜观察以及免疫组织化学方法,研究不同频率局部振动治疗对大鼠坐骨神经损伤后再生神经组织形态学以及神经生长相关因子的含量表达作用。方法:清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠144只,随机分为模型组(n=24)、治疗组(n=72),假干预组(n=24),假手术组(n=24),前四组均建立右侧坐骨神经钳夹伤模型。治疗组予3Hz、8Hz、13Hz频率振动大鼠臀大肌肌腹中央,2min/次,1次/天,模型组和正常组无特殊干预。分别于治疗后第1、2、4周进行损伤部位远端神经取材切片电镜观察及免疫组化半定量分析,评估振动治疗对大鼠坐骨神经损伤后再生神经组织形态学及促进神经生长相关因子蛋白表达的作用。结果:(1)电镜观察:治疗后1周各组均出现华勒变性,模型组、假干预组无髓鞘纤维明显,板层结构模糊,间隙增宽,各组均可见新生髓鞘,但髓鞘较薄,治疗组新生髓鞘较模型组多且形态较其规整,提示治疗1周时神经进入再生阶段,轴丝增多且向远端生长;2周时,模型组、假干预组髓鞘排列不紧凑,形态欠规则,有髓神经纤维呈扁平状,治疗组新生髓鞘增多,髓鞘密度较模型组、假干预组高;4周时,模型组、假干预组髓鞘厚度较薄,再生神经纤维髓鞘形成不完整,脱髓鞘现象存在且髓鞘密度低,各治疗组有髓神经纤维分布较模型组、假干预组致密,髓鞘厚度亦较模型组、假干预组高,再生神经纤维的髓鞘结构较均匀,可见施万细胞,治疗组各组织形态变化不大,但4周时8Hz脱髓鞘现象较3Hz、13Hz多。结果提示振动治疗可促进大鼠坐骨神经损伤后的再生神经形态学恢复。(2)S-100神经表达:治疗后1周,振动治疗组S-100蛋白平均光密度表达均较假干预组升高(P<0.05),但治疗组中3Hz、8Hz、13Hz之间无统计学差异(P>0.05);治疗2周,治疗组与假干预组相比,两者存在统计学差异(P<0.001),治疗组中3Hz较8Hz、13Hz的S-100表达升高,且与8Hz、13Hz均存在统计学差异(P<0.05);治疗4周,治疗组S-100蛋白含量均保持较高水平,与假干预组相比有统计学差异(P<0.001),而在治疗组中3Hz S-100表达高于8Hz、13Hz,其有持续升高的趋势但与8Hz、13Hz相比较无统计学差异(P>0.05)。同一组别中,假干预组的S-100表达第1周与第2周、4周有统计学差异(P<0.05),但第2周及第4周则无明显差异(P>0.05),各治疗组的S-100表达亦随着时间的延长而大量增殖活跃,第1周与第2、4周有统计学差异(P<0.05),第2、4周则无明显差异(P>0.05)。(3)BDNF神经表达:治疗1周,治疗组BDNF表达均高于假手术组(P<0.05),治疗组中3Hz、8Hz、13Hz之间无统计学差异(P>0.05);治疗2周,各治疗组与假干预组相比差异有统计学意义(P<0.05),治疗组中第2周以13Hz上升最高,但3Hz、8Hz、13Hz之间无统计学差异(P>0.05);治疗4周,各治疗组均保持较高水平,与假干预组比较存在统计学差异(P<0.05),3Hz组第4周表达强阳性,与8Hz组两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。同一组别中,假干预组各时间点无显著变化(P>0.05);3Hz BDNF表达第1、2周无统计学差异(P>0.05),但二者与第4周存在统计学差异(P<0.05);8Hz BDNF表达1周与2周、4周均存在统计学差异(P<0.05),2周与第4周则无统计学差异(P>0.05);13Hz组BDNF的表达与8Hz组的趋势基本相同,第1周与第2、4周均存在统计学差异(P<0.05),2周与4周则无统计学差异(P>0.05)。(4)CNTF神经表达:治疗1周,治疗组与假干预组CNTF表达无统计学差异(P>0.05);治疗2周,各治疗组CNTF表达明显高于假干预组且差异有统计学意义(P<0.05),但治疗组3Hz、8Hz、13Hz之间无统计学差异(P>0.05);治疗4周,各治疗组均保持平稳稍上升趋势,与假干预组比较存在统计学差异(P<0.05),3Hz组在第4周CNTF表达较8Hz、13Hz有上升趋势。同一组别中,假干预组在第1、2周时变化无统计学差异(P>0.05),但第1、2周均与第4w存在统计学差异(P<0.05),提示CNTF表达可能随着时间的增长慢慢恢复。3Hz组第2、4周的CNTF表达均高于1周(P<0.05),但治疗2周与4周二者之间无统计学差异(P>0.05);8Hz组、13Hz组CNTF表达第2、4周均高于第1周,且存在统计学差异(P<0.05),而2周、4周两个时间点间无统计学差异(P>0.05),第4周时仍以3Hz的表达最高,呈上升趋势。结论:不同频率振动治疗均可促进坐骨神经钳夹伤大鼠的再生神经组织形态学恢复;提高施万细胞S-100蛋白表达,促进神经营养因子BDNF、CNTF的分泌,且3Hz优于8Hz及13Hz。