中药中含有多种化学成分,作用机制非常复杂,可以通过靶向多个靶点和通路发挥治疗效果。目前缺少一种系统的实验方法对中药的作用机制进行研究,而网络药理学致力于寻找调节多个靶点和通路的药物,或者将药物进行组合治疗疾病,减少病人用药量以降低毒副作用,它的发展为中药治疗疾病的机制研究提供了新的方法。目前,国内外学者利用网络药理学方法对多个中药经典方剂进行了阐释,如Xiang Li等建立了化合物-靶点-通路网络,研究了中药方剂芪参益气汤潜在的活性化合物的作用靶点和通路;Linli Wang等通过网络药理学对血塞通注射剂多靶点、多通路的复杂作用机制进行了研究[1,2]。银翘散是中医经典方剂之一,在治疗常见的感冒、发烧、咳嗽及其他气管性疾病方面有着悠久的历史。关于银翘散的实验研究和临床应用报道已有很多,但是系统研究银翘散作用机制的报道很少。本论文采集感染流感病毒小鼠肺组织中的基因表达数据,构建流感病毒感染小鼠的“症候网络”,研究银翘散对症候网络的影响,以期全面揭示银翘散抗流感作用机制。1、构建感染甲型流感病毒的小鼠模型,分别在造模成功后第1、3、5天取正常组、模型组、达菲阳性对照组和银翘散治疗组小鼠的肺组织,提取肺组织中的总RNA。通过高通量测序的手段获得小鼠肺组织中基因表达量的数据,经过生物信息学方法计算分析后,得到了各处理组小鼠肺组织基因表达网络指纹图,构建了流感病毒感染小鼠“症候网络”。通过分析“症候网络”发现感染流感病毒后,小鼠体内JAK/STAT、PI3K/Akt、抗原加工与提呈、肠道免疫等通路受到抑制,而肾上腺素能通路、唾液分泌和胃酸分泌被活化。为了说明流感病毒感染小鼠“症候网络”的可靠性,本文通过实时荧光PCR和蛋白免疫印迹的方法对网络中的一些靶点进行了研究。结果发现,在感染流感病毒后小鼠肺组织中Saa1、Iigp1、Ms4a6d、Oasl2、Sectm1a、Gbp6、Plac8、Gbp11等基因相对表达量显著增加,与“症候网络”的分析结果一致。小鼠感染甲型流感病毒后,小鼠肺组织中Gbp6蛋白水平随着时间延长而减少,Iigp1蛋白水平随着时间延长而增加,Oasl2蛋白表达水平先下调而后逐渐上调。本文选取蛋白水平变化明显的Gbp6、Iigp1和Oasl2作为靶点,设计了它们的反义核酸。将反义核酸腹腔注射到小鼠体内,观察这三个靶点的反义核酸对流感病毒感染小鼠的影响,发现Iigp1反义核酸组(i.p.,5mg/kg)小鼠存活20%,Iigp1反义核酸组(i.p.,20mg/kg、10mg/kg)全部死亡,oasl2反义核酸组(i.p.,10mg/kg、5mg/kg)小鼠存活10%,oasl2反义核酸组(i.p.,20mg/kg)小鼠全部死亡。本文又选取了基因oasl2作为研究目标,利用小干扰沉默和质粒过表达技术研究oasl2与甲型流感病毒复制的关系。实验结果发现:经气管接受si-oasl2后小鼠肺组织中oasl2基因和蛋白表达水平都显著下调,其肺组织中m基因的相对表达量与阴性对照组比较显著上调,ha蛋白的表达水平出现上调,且流感病毒的病毒滴度增加;当a549细胞中oasl2表达上调时,细胞中m基因相对表达量下调,ha蛋白表达水平下调,且培养基上清中病毒滴度也降低。2、银翘散是由9味中药组成的,金银花和连翘构成了处方的君药,薄荷、牛蒡子、荆芥和淡豆豉构成了处方的臣药,竹叶和桔梗构成了处方的佐药,甘草是处方的使药,本文将银翘散的君臣佐使重新进行配伍组合,分别是君臣佐、君臣使、君佐使和君臣配伍,灌胃感染甲型流感病毒感染的小鼠,在造模成功后第3、5天摘取小鼠的肺组织并提取肺组织中的总rna,通过高通量测序的手段获得小鼠肺组织中基因表达量的数据,经过生物信息学方法计算分析后,结合第一部分流感病毒感染小鼠“症候网络”模型,综合分析后发现银翘散能使jak-stat和抗原加工与提呈通路的抑制水平得到缓解、降低凋亡通路活性程度。为了证实构建的网络的可靠性,本文选取了jak/stat和pi3k/akt两条通路作为靶点,利用实时荧光pcr法和蛋白免疫印迹法研究了银翘散及其拆方对这两条通路的影响,发现君臣佐、君臣使、君佐使和君臣配伍组对jak/stat和pi3k/akt等通路的改变起到恢复作用,这与获得的网络分析结果一致,说明了构建网络方法及结果的可靠性。3、本文研究了银翘散中各味药的主要化学成分对流感病毒感染小鼠存活率的影响,发现连翘苷对流感病毒感染小鼠具有一定的保护作用。连翘是银翘散中的君药,而连翘苷又是连翘中的主要成分之一,本文探讨了连翘苷对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用,为银翘散抗流感作用机制提供支持。首先通过连翘苷对小鼠存活率和平均存活时间的影响观察连翘苷对流感病毒感染小鼠的保护作用;然后通过小鼠肺指数、小鼠血清中细胞因子的浓度和小鼠肺组织病理变化等三个指标研究了连翘苷对流感病毒感染小鼠肺组织炎症的影响;另外通过小鼠肺组织中m基因的相对表达量、ha蛋白的表达水平和流感病毒病毒滴度研究了连翘苷对小鼠肺组织中流感病毒复制的影响;最后利用拉曼技术研究了连翘苷对小鼠血清中代谢产物的影响。实验发现,与模型组比较:连翘苷(i.p.,20mg/kg)提高小鼠存活率20%,并显著延长小鼠平均存活时间至8.7天,减缓小鼠因感染流感病毒导致的体重减轻;与模型组比较,小鼠在感染流感病毒后第5天,连翘苷能显著降低小鼠的肺指数和小鼠血清中IL-6和GM-CSF的浓度,在流感病毒感染小鼠后第3天和第5天,连翘苷能减轻小鼠肺部炎症细胞浸润,使小鼠肺部肺泡腔内分泌物较少,减轻流感病毒感染小鼠的肺损伤;在流感病毒感染小鼠第5天,连翘苷(i.p,20mg/kg)显著降低小鼠肺部HA蛋白的表达水平和小鼠肺组织中流感病毒的病毒滴度。本文利用网络药理学的思路和方法构建了结果可靠的流感感染小鼠“症候网络”,并发现银翘散及其拆方可以不同程度的调节这一网络,且银翘散中的单体化学成分连翘苷具有抗流感作用,并利用SERS技术初步探索了连翘苷对小鼠血清中代谢产物的影响,为中药研究提供了新的思路和方法。研究结果提示:银翘散可通过方剂中化学成分的抗流感作用及其自身作用于小鼠体内的多个靶点和通路发挥抗流感作用。