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目的构建基于磁性分离和催化发夹组装信号放大策略的外泌体双膜蛋白共表达检测平台。研究方法1.外泌体纯化及表征:以MDA-MB-231细胞为实验对象。细胞上清液经超速离心机分离得到外泌体。透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)拍摄鉴定分析外泌体形态和大小;纳米粒子跟踪分析仪Nanoparticles Tracking Analysis,NTA)检测外泌体粒径和浓度;免疫印迹(Western Blot,WB)检测外泌体蛋白表达情况;外泌体实时荧光定量核酸扩增试验。2.催化发夹组装(Catalytic Hairpin Assembly,CHA)筛选:三组 CHA(CHA1、CHA2、CHA3)根据电泳结果和荧光检测选择最佳。3.基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体蛋白共表达检测平台可行性:以MDA-MB-231细胞为实验对象,①超分辨成像技术与免疫印迹实验验证CD63在其外泌体膜上的表达。②多维高清流式细胞分析仪验证外泌体磁珠法富集及效率。③不同浓度外泌体与 AptEpCAM-T 催发链(Aptamer,Apt;Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)反应电泳图验证AptEpCAM-T与外泌体结合。4.基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体蛋白共表达检测平台检测原理及可行性验证:①不同浓度AptEpCAM-T催发链荧光检测;②CHA检测平台电泳。5.CHA优化反应条件:对反应缓冲液、反应pH、反应温度和反应时间进行优化。6.检测平台特异性试验:在最优反应条件下,用本检测平台对不同细胞来源的外泌体(人正常乳腺上皮细胞、乳腺癌细胞、人支气管上皮细胞、人非小细胞肺癌)进行荧光检测,同时记录其荧光响应值信噪比。实验重复两次。实验结果1.外泌体纯化及表征:MDA-MB-231细胞外泌体的TEM图像为具有完整的膜性脂质双分子层结构,直径在100 nm左右;NTA平均粒径为155nm,浓度为4.01×1011/ml,WB结果:蛋白TSG101、蛋白CD63在其外泌体表达,而蛋白Cαlnexin不表达。外泌体实时荧光定量核酸扩增检测CT(Cycle threshold,CT)值小于30。2.CHA筛选:CHA2为最佳,电泳显示发夹结构H1、H2稳定,两者无明显自反应现象,在催发链T的作用下可发生无酶反应且条带明显,荧光检测信噪比高。3.基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体蛋白共表达检测平台可行性:①超分辨成像技术与免疫印迹实验显示MDA-MB-231细胞来源外泌体富含CD63膜蛋白。②磁珠法捕获外泌体效率为90%;③不同浓度外泌体与APtEpCCAM-T催发链反应电泳结果显示AptEpCAM-T能够识别并结合外泌体。4.基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体蛋白共表达检测平台检测原理及可行性验证:①随着AptEpCAM-T浓度增加荧光响应值明显增加。②电泳显示CHA组分稳定,H1-H2无明显自反应现象,在催发链T的作用下可发生无酶反应且条带明显。5.CHA条件优化试验:选择pH 7.4缓冲液Tris-HC1为反应液,37℃下,CHA达到荧光响应最大值需60 min。6.检测平台特异性试验:人正常乳腺上皮细胞荧光检测响应值信噪比:1.10±0.01,乳腺癌细胞外泌体荧光检测响应值信噪比:2.09±0.08。人支气管上皮细胞外泌体荧光检测响应值信噪比:1.17±0.10,人非小细胞肺癌外泌体荧光检测响应值信噪比:1.19±0.01。结论构建了基于磁性分离和催化发夹组装信号放大策略的外泌体双膜蛋白共表达检测平台。检测平台可同时检测外泌体膜上表达的两种蛋白:CD63和EpCAM。乳腺癌细胞外泌体与人正常乳腺上皮细胞外泌体的蛋白CD6和蛋白EpCAM表达有区分度。该检测平台为具有诊断价值的外泌体膜蛋白的双重检测提供通用平台,也为多靶标膜蛋白检测提供可能性。