特基拉芽孢杆菌D8杀藻活性物质分离及生态效应评价

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赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)繁殖速度快、昼夜均能摄取营养,是形成赤潮的主要藻种,在世界多个海域均有该物种的分布,其爆发时会导致养殖鱼类大量死亡,严重危害海洋环境和养殖业可持续发展。目前,关于赤潮治理的方法主要有物理、化学和生物法。相比于物理法和化学法存在高成本、二次污染的问题,生物法因其高效、安全等优势受到人们的广泛关注,因此杀藻菌和杀藻活性物质的分离鉴定成为目前赤潮防治的热点问题。本研究首先从福建省厦门市第一码头分离到一株高效杀藻菌株,通过形态观察和16S rRNA序列比对鉴定其为特基拉芽孢杆菌D8(Bacillus tequilensis D8),并对其杀藻方式、杀藻谱范围、杀藻稳定性和杀藻机理开展研究,接着通过构建赤潮异弯藻微宇宙体系来评估该杀藻活性物质的生态安全性。最后通过多种化学手段分离并鉴定其杀藻活性物质为Surfactin类物质。主要的研究结果如下:(1)从厦门市第一码头分离到一株对赤潮异弯藻有高效杀藻效果的菌株D8,经16S rDNA基因序列比对结果显示菌株D8与Bacillus tequilensis KCTC 13622T的相似率高达99.7%;结合菌落特征与扫描电镜形态观察,确定菌株D8为芽孢杆菌属;(2)5%D8无菌上清液处理赤潮异弯藻72 h后的杀藻率高达96.3%,与5%D8培养液的杀藻活性基本一致,而其菌体无明显杀藻活性,表明菌株D8的杀藻方式为间接杀藻。不同的温度、光强和酸碱处理上清对其杀藻效果无明显的影响,说明杀藻活性物质有良好的热稳定、光稳定性和酸碱稳定性。(3)通过对菌株D8杀藻谱进行测定,其结果表明芽孢杆菌D8主要对硅藻门、针胞藻门和甲藻门的藻株具有良好的杀藻活性,但对蓝藻门和绿藻门的杀藻活性低。5%D8上清液对假微型海链藻、中肋骨条藻、赤潮异弯藻和东海原甲藻72 h的杀藻率均可达90%左右。(4)上清经酸沉淀和氯仿甲醇初步分离获得D8粗提物,D8粗提物对赤潮异弯藻的杀藻机理表明,D8粗提物首先是攻击细胞膜,接着当D8粗提物进入细胞后会导致胞内的脂酶失活;同时还会攻击细胞器膜如类囊体膜,导致细胞的光合系统受损,光合色素含量显著降低,电子传递速率明显降低,最终,由于细胞膜严重受损导致细胞崩解死亡。(5)在微宇宙体系中,D8粗提物对赤潮异弯藻仍有良好的杀藻效果,加入D8粗提物2d后的杀藻率达到77.7%。赤潮爆发后,对照组、DMSO(二甲基亚砜)处理组和D8粗提物处理组的群落Alpha多样性(Sobs指数、Shannon指数和PDwholetree指数)均显著降低,表明赤潮爆发会导致细菌群落多样性的变化,明确赤潮治理的必要性。另外由Beta多样性分析可知,Control30d的细菌群落与原始海水差异显著,而DMSO30 d和D830 d细菌群落组成与原始海水更接近,推测DMSO有利于赤潮爆发后细菌群落的恢复,而D8粗提物对细菌群落组成影响相对较小。对照组、DMSO处理组和D8粗提物处理组在门、纲和科水平上的优势类群分别为变形菌门、α-变形菌纲和红杆菌科。无论是在门水平、纲水平还是科水平,D8粗提物处理组的优势类群的丰度与原始海水均无显著差异。但在属水平上DMSO和D8粗提物的加入使优势类群由Maritimibacter变成Marivita。由于Marivita具有DMSO还原酶,可以将DMSO还原成二甲基硫(Dimethyl sulfide,DMS)而释放到空气中,推测属水平上的变化主要是由DMSO的引起的。综上说明D8粗提物对微宇宙群落结构无显著影响,其用于赤潮防控是相对安全的。(6)通过排油圈实验确定D8粗提物含有生物表面活性剂类物质,利用高效液相色谱检测粗提物发现其主要包括4个组分,进一步通过杀藻实验确定D8的杀藻活性组分主要包括3种,分别为组分2、3和4。(7)利用ODS柱层析和制备液相色谱获得组分2、3和4的纯品,通过液质联用仪分析确定组分2、3和4的分子量分别为1008、1022和1036,并且通过分析二级质谱的裂解规律,发现组分2、3和4的氨基酸组成是一样的,从C端到N端,分别为谷氨酸—亮氨酸—亮氨酸—缬氨酸—天冬氨酸—亮氨酸—亮氨酸。结合三者的核磁共振1H谱和13C谱,可以确定三者为Surfactin类的同系物,分别为 Surfactin-C13、Surfactin-C14 和 Surfactin-C15。
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