【摘 要】
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长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)具有影响鱼类的脂代谢、细胞膜功能、免疫性能、生长和繁殖性能等的生理功能特性。ELOVL4是一种位于内质网上膜蛋白,具有调节超长链饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的功能。ELOVL4是目前硬骨鱼类延长酶家族的主要研究对象。泥鳅作为一种小型经济鱼类,关于其elov4基因研究鲜有报道。本论文主要以泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)为研究对象,对脂肪酸
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长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)具有影响鱼类的脂代谢、细胞膜功能、免疫性能、生长和繁殖性能等的生理功能特性。ELOVL4是一种位于内质网上膜蛋白,具有调节超长链饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的功能。ELOVL4是目前硬骨鱼类延长酶家族的主要研究对象。泥鳅作为一种小型经济鱼类,关于其elov4基因研究鲜有报道。本论文主要以泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)为研究对象,对脂肪酸合成的关键酶ELOVL4展开相关研究,为elovl4基因在脂肪酸合成代谢中的功能研究提供理论基础。主要研究内容结果如下:1.泥鳅elovl4基因生物学信息和不同组织表达分析本研究中,通过RACE克隆获得了泥鳅elovl4a和elovl4b c DNA全序列。泥鳅elovl4a和elovl4b基因全长分别为2423和2054bp,编码315和300个氨基酸。泥鳅elovl4a和elovl4b分别与斑马鱼的elovl4a和elovl4b的相似度很高,而两者之前的相似度却较低。通过对泥鳅elovl4a和elovl4b在泥鳅不同发育时期和不同组织表达分析发现,elovl4a基因除了在心脏组织不表达外,在其余组织均有表达。而elovl4b基因主要特异性表达于眼睛、脑、肾脏、脾脏、肠道及肌肉组织。在不同发育时期,elovl4a和elovl4b从受精卵开始高达,并且在整个胚胎发育时期均表达量很高。2.泥鳅elovl4基因在酵母及鳍条细胞中的功能鉴定对elovl4a和elovl4b的功能进行验证分析,在酿酒酵母外源表达系统发现其具有延长脂肪酸的能力,特别是将C18不饱和脂肪酸延长为更长链的不饱和脂肪酸。泥鳅elovl4a和elovl4b均可将本实验添加的脂肪酸18:2n-6,18:3n-3,18:3n-6,20:4n-6和20:5n-3延长为更长链脂肪酸。进行了泥鳅鳍条细胞添加不同浓度的18:2n-6和18:3n-3后elovl4a和elovl4b基因表达变化实验。结果表明添加外源脂肪酸后,泥鳅鳍条的elovl4a和elovl4b均显著性的上调。上述结果表明泥鳅elovl4基因可将C18不饱和脂肪酸延长为C20不饱和脂肪酸。本研究系统性的研究了elovl4对C18不饱和脂肪酸的延长能力,完善了elovl4在HUFA合成中的功能。3.ELOVL4互作蛋白筛选为筛选出ELOVL4的互作蛋白,本研究构建了斑马鱼酵母双杂交c DNA文库。结果表明c DNA文库重组率为94.4%,插入片段范围为300-2000bp,说明构建的酵母双杂交c DNA文库质量良好。构建并鉴定了p GBKT7-ELOVL4诱饵载体,检测了其自转录活性和细胞毒性。结果表明p GBKT7-ELOVL4在SD/-Trp固体上培养基有淡红色酵母菌生长,在SD/-Trp/X-α-gal固体培养基上有淡蓝色酵母菌生长,在SD/-Trp/X-α-gal/Ab A无酵母菌生长;且生长于SD/-Trp培养基的p GBKT7-BD酵母菌大小与实验组无差异。表明p GBKT7-ELOVL4诱饵载体无自激活且无细胞毒性,可应用于筛选其互作蛋白。通过酵母双杂交,筛选到与ELOV4A互作的蛋白12个,与ELOVL4B互作的蛋白12个。ELOVL4A主要与参与卵巢功能、肌肉组织、胚胎发育和脂肪代谢的蛋白发生相互作用,ELOVL4B主要与参与卵巢、肌肉和胚胎发育的蛋白存在相互作用,为ELOVL4的后续研究奠定了基础。
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