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颞下颌关节紊乱病(Temporomandibular disorder,TMD)近年来被广泛的报道,是一种较高发病率的疾病。颞下颌关节骨关节炎(temporomandibular joint osteoarthritis,TMJ OA)是TMD的最主要病理过程。颞下颌关节与牙齿咬合有着十分密切的关系,异常咬合导致的异常生物力,是TMJ OA最重要的致病因素。在OA疾病中最主要的病理变化是软骨的退行性改变。在退变软骨中,软骨细胞凋亡、自噬和终末分化的加剧共同导致了软骨细胞的减少。内质网应激诱导的细胞凋亡与自噬密不可分,细胞生理性自噬会保护细胞免于向凋亡发展,而细胞凋亡则会进一步激活自噬的发生来清除出现问题的细胞亚结构。MTORC1分子在平衡细胞自噬中起到了关键性作用,在TMJ OA软骨中自噬和凋亡的平衡以及MTORC1在其中的作用尚缺乏细致的研究。许多文献报道,软骨细胞终末分化会在OA中加剧。关节软骨中的软骨细胞从浅到深分层次排列,浅层软骨细胞以增殖活动为主而深层软骨细胞以成熟和分化为主。Ihh-PTHrP负反馈信号轴在生长板软骨细胞成熟分化过程中,发挥着关键作用,但在TMJ OA软骨中,鲜有报道相关机制和对软骨细胞的作用机理。我课题组创新性的建立了动物的TMJ OA模型,即单侧前牙反牙合(Unilateral Anterior Crossbite,UAC)的异常咬合刺激,通过对大小鼠的刺激能够诱导TMJ软骨出现典型的OA样退行性变。我们的结果表明UAC会加速髁突软骨细胞的凋亡,软骨细胞终末分化加剧并伴随基质分泌减少、炎性因子和蛋白酶活性增强,同时抑制其增殖活动,早期即出现软骨下骨吸收等。我们课题组也创新性的建立了流体剪切力(fluid flow stream stress,FFSS)的体外模型来模拟软骨细胞在体内受到的异常生物力,并且获得了与UAC同样的效果。本研究基于UAC和FFSS,首先分析TMJ OA软骨中内质网应激所致细胞凋亡、自噬和终末分化平衡失调特征;其次探索MTORC1在内质网应激所致细胞凋亡和自噬平衡中的分子调控机制;然后验证Ihh-PTHrP信号轴在UAC所致髁突软骨细胞异常分化中的作用特点。从而以体外干预、基因敲除和在体注射等方法,论证MTORC1、Ihh、PTHrP信号对TMJ OA软骨细胞凋亡、自噬、终末分化活动的调控机制。研究结果:1.UAC实验组大鼠髁突软骨出现细胞数量减少,厚度降低,并且伴随着基质中蛋白多糖表达的减少的退行性改变;UAC/FFSS刺激下深层髁突软骨细胞出现明显的未折叠蛋白反应,与应激相关的HSPA5、EIF2AK3、ERN1和ATF6等分子高表达,钙离子内流诱导钙超载,出现细胞内质网应激;在内质网应激的情况下,UAC实验组髁突软骨细胞高表达CASP12和DDIT3,说明内质网途径细胞凋亡持续存在。自噬形成分子BECN1和LC3B-II在早期(<8周)高表达,8周后表达下调,而且自噬溶酶体融合受到抑制,说明细胞自噬只在早期的刺激中被激活,而到了晚期OA其活性被抑制。同时,UAC/FFSS刺激下,TMJ中深层的软骨细胞会出现明显的终末分化现象,软骨退行性改变加重并伴随着软骨基质表达的减少。此外,UAC实验组TMJ深层软骨细胞中终末分化分子Alp、Col10、Mmp13、Opn和Runx2的表达增强。2.采用GSK2606414和rapamycin等药物干预实验证实,MTORC1的表达在UAC实验早期(<8周)被抑制,其负向调控细胞自噬的活动被激活,而晚期(>8周)MTORC1高表达,通过EIF2AK3直接激活内质网途径凋亡,同时活化的EIF2AK3能够抑制自噬溶酶体的融合(LAMP2和LC3B-II的重叠)。进一步,通过FFSS刺激验证了在内质网应激下ERN1的活化也会通过AMPK信号抑制MTORC1的活性来激活细胞自噬分子BECN1和LC3B-II的表达,并且抑制EIF2AK3介导的内质网途径凋亡。因此,可以通过rapamycin药物抑制MTORC1或通过软骨组织特异性诱导型基因敲除小鼠敲除Mtor分子来抑制MTORC1介导的内质网途径凋亡、增强细胞自噬,保护OA软骨,减轻退变。相反,MHY1485药物注射或基因敲除Tsc1来激活MTORC1促进内质网途径凋亡、抑制自噬,加重OA病变。3.在UAC实验组中,浅层软骨细胞会高表达PTHrP,而PTHrP的唯一受体PTH1R主要表达在深层软骨细胞中并随着UAC的刺激表达降低。通过软骨组织特异性诱导型基因敲除软骨细胞PTH1R,可加重UAC导致的终末分化。通过在UAC大鼠TMJ关节腔注射Ihh抑制剂Vism或是在软骨特异性诱导型敲除Ihh的受体Smo,均可以提高PTH1R的表达,进而抑制终末分化的发生并维持软骨的厚度和基质的含量。但如果同时敲除Smo和PTH1R基因,那么UAC刺激下小鼠TMJ软骨细胞会表现出终末分化增强的PTH1R敲除表型。研究结论:1.UAC所致TMJ OA退行性改变的主要病理变化是髁突深层软骨细胞的凋亡、自噬和终末分化。2.内质网应激导致的细胞凋亡从UAC刺激的早期便比较活跃,而细胞自噬增强主要出现在OA早期,ERN1和EIF2AK3分子调节着凋亡和自噬的平衡,MTORC1则在ERN1和EIF2AK3分子调节过程中发挥着分子开关作用。因此MTORC1可以是OA治疗的一个重要靶点。3.Ihh和PTHrP信号共同调控着UAC刺激下TMJ OA软骨细胞的终末分化活动,抑制Ihh信号通过抑制软骨细胞终末分化来减缓TMJ OA病变,这一作用具有PTHrP信号依赖特征。