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大豆疫霉（Phytophthorasojae）侵染大豆引起的根腐病是大豆生产的毁灭性病害之一。大豆疫霉在与寄主的互作过程中会分泌大量的外泌蛋白，过去几年的研究已经证明，这些外泌蛋白通过干扰植物免疫反应，在病原菌致病过程中发挥重要作用。但是这些外泌蛋白如何被运输到胞外则缺乏研究，对病原菌控制该过程分子机理的研究对针对该过程发展新的病害控制策略具有重要价值。尽管关于真核生物蛋白分泌途径已经有一些研究，但是由于卵菌与其他真核生物遗传距离很远，其发育与致病的机理均缺乏研究。本文综合利用生物信息学，realtimeRT-PCR，基因沉默技术对大豆疫霉信号识别颗粒亚基SRP54和动力相关蛋白VPS1在大豆疫霉蛋白分泌过程中的作用进行了系统的分析，希望为解释疫霉菌的致病机理，设计新的疫病控制策略提供帮助。 大豆疲霉信号识别颗粒亚基SRP54和动力相关蛋白VPS1的生物信息学预测及转录分析.信号识别颗粒是真核生物中普遍存在的一个重要的复合体，通过识别核糖体上新生肽的信号肽，并与之结合，将外泌多肽易位进入内质网中进入外泌途径，而动力相关蛋白VPS1影响了高尔基体上包被了液泡蛋白的囊泡出芽，并最终影响外泌蛋白的外泌。本研究通过生物信息学方法方法从大豆疫霉、橡树疫霉和致病疫霉等的全基因组数据库中挖掘出信号识别颗粒亚基SRP54候选编码基因。对P.sojae，P.parasitica,P.cinnamomi,P.capsiciP.ramorum,P.infestan,H.Arabidopsis,Pythium和S.parasitica9种卵菌中SRP54及VPS1的候选基因之间进行了同源性比较，分析了蛋白的结构特征。PsSRP54蛋白具有保守的GTPase结构域，富含蛋氨酸的C端结构域，它能结合7SRNA也能结合信号肽。而且VPS1蛋白在N端也具有保守的GTPase结构域，说明这两个蛋白在进化过程中非常的保守。利用RNA-sequencing和qRT-PCR等技术分析了大豆疫霉中SRP54及VPS1候选编码基因在生活史及侵染各个阶段的转录情况，发现SRP54在茵丝阶段、孢子囊阶段、侵染1.5h、3h、6h、12h及24h阶段均上调表达，而VPS1在菌丝阶段、孢子囊阶段、休止孢萌发阶段、侵染1.5h、3h、6h、12h及24h阶段也均上调表达，这意味着两个基因在侵染过程中起着重要的作用，这为后续功能基因研究提供了重要的线索。 信号识别颗粒亚基PsSRP54参与了卵孢子的形成、蛋白的外泌和致病过程:在本章研究中，通过生物信息学鉴定了一个大豆疫霉PsSRP54基因，该基因编码一个信号识别颗粒的54亚基。利用大豆疫霉稳定转化系统，获得了该基因的3个沉默突变体。PsSRP54的沉默突变体在固体平板上减少胞外过氧化物酶的外泌量，液体培养基的滤液（及胞外蛋白）在本氏烟草叶片上引起坏死的能力显著下降，通过SDS-PAGE蛋白的测定发现CBEL激发子的分泌量明显降低;通过接种含有抗病基因的鉴别寄主沉默转化子不能引起明显的HR反应，对比胞外蛋白显示沉默转化子的外泌蛋白量明显降低;沉默转化子接种感病品种致病力明显减弱。同时在获得的OEX-Avr1b菌株（在P6497中过量表达Avr1b-RFP-HA）中瞬时沉默PsSRP54得到的转化子能够恢复菌株在Harosoy13xy(RPS1b)的致病力。通过荧光观察发现转化子中的荧光明显减弱，而且Westernblot显示转化子与OEX-Avr1b相比Avr1b的外泌量明显降低。与对照相比，PsSRP54的沉默并没有影响茵丝生长速度，孢子囊的形成及游动孢子的释放，但是卵孢子的形成和产量显著降低P6497中在10倍镜视野下平均70个，而沉默突变体中平均只有5个。上述结果表明，PsSRP54可以调控大豆疫霉胞外蛋白的分泌及效应分子的外泌，进而影响致病力，而且参与了卵孢子的形成。 动力相关蛋白VPS1参与调控大豆麦霉休止孢萌发，蛋白外泌争致病过程:VPS1编码一个典型的动力相关蛋白，同时PsVPS1也作为液泡分选蛋白一员，而且在已测序的卵茵中是高度保守的。通过利用大豆疫霉稳定转化系统将该基因沉默并获得了3个沉默转化子。PsVPS1沉默突变体的生长速度显著降低，沉默转化子平均每天生长速率为0.65cm，而P6497平均为0.9cm。PsVPS1沉默后对游动孢子产量没有显著影响，同时游动孢子的游动行为也没有受到显著影响，具有正常的趋化性;有性生殖也没有变化，卵孢子形态及产量与野生型没有差异。但是沉默突变体中休止孢萌发出现显著异常，休止孢萌发的顶端膨大，而且分枝增加，进一步对细胞壁染色观察发现，葡聚糖的分布受到显著的影响。PsVPS1沉默突变体在固体平板上胞外过氧化物酶外泌量明显降低，接种鉴别寄主发现沉默转化子失去引起HR反应的能力。转化子接种感病品种致病力明显下降，通过显微观察发现转化子的休止孢能够正常的穿透寄主表皮，但是侵染菌丝不能在寄主细胞内进一步扩展。以上结果表明，PsVPS1沉默影响了休止孢的正常萌发及极性生长，同时减弱了胞外蛋白的外泌，降低了在感病品种的致病力。 通过生物信息学分析，结果显示PsSRP54和PsVPS1在外泌途径中非常的保守，而且在侵染的不同阶段都上调表达。功能分析发现，PsSRP54和PsVPS1在蛋白外泌和致病力中都具有重要的作用。在OEX-Avr1b菌株中瞬时沉默PsSRP54证实SRP54参与效应分子的外泌。本论文第一次在植物病原菌中报道SRP54和VPS1的功能，也在卵茵中同时运用稳定转化和瞬时转化研究基因功能和效应分子的外泌，为效应分子外泌机制的深入研究奠定基础。