系统研究特定信号转导通路网络及其动态变化过程是全面揭示该网络调控和作用机制的关键，也是目前组学研究的热点之一。胰岛素信号转导通路网络相对简单，具有调节胞内物质代谢和细胞生长的重要功能，通过研究其中重要分子在信号转导过程中形成的蛋白质复合体的动态变化，有助于全面揭示该网络发挥调控功能的分子机制。串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP)技术是近年发展起来的用于研究蛋白质复合体的新方法。TAP技术较其它纯化技术最大的优势在于可以分离接近生理条件的蛋白质复合体。借鉴国外在研究信号转导通路复合体方面的先进经验，我们拟采用TAP联合质谱技术(TAP-MS)开展胰岛素信号转导通路网络的相关研究。作为研究工作的基础，我们首先通过改构表达载体、建立表达蜕皮激素受体的人肝癌细胞株(HepG2)，并对其进行筛选和评定，成功将蜕皮激素诱导表达系统引入TAP体系，实现了控制外源靶蛋白表达水平接近生理状态，以获得接近真实生理情况的靶蛋白质复合体的目的，该体系可望广泛应用于高等真核细胞的蛋白质复合体研究。同时，我们从目前已知的胰岛素信号转导通路网络相关分子中，挑选了11个作为TAP纯化鉴定的靶基因，克隆并构建了其各自的蜕皮激素诱导表达载体(pIND-His/N5)，为系统开展后续研究奠定了基础。为验证技术路线的可行性，我们将Akt1作为首选研究对象。Akt1即蛋白激酶B(PKB)是P13K/Akt信号转导通路的关键分子之一，参与调控细胞物质代谢、细胞迁移、增殖和存活等多种生物学过程，纯化鉴定Akt1蛋白质复合体有助于阐明其作用和调控的分子机制。我们在所建立的表达蜕皮激素受体的HepG2细胞株基础上，筛选并建立了稳定表达Akt1-TAP融合蛋白的可诱导HepG2细胞株，并在接近生理条件下采用TAP技术分离纯化了Akt1蛋白质复合体。通过质谱鉴定复合体组成，获得了87个Akt1的候选相互作用蛋白质，其中包括诱饵蛋白质Akt1。为了降低假阳性提高数据的可信度，我们采用多种生物信息学方法分析结果，包括比较已知的相互作用、整合基因敲除表型数据、分析GO功能注释和检索蛋白质序列保守的Akt1磷酸化位点，对获得的相互作用的可信度和生物学相关性进行系统评价。结果表明，4个候选分子为Akt1已知的相互作用蛋白质(MYLK2、CDC25B、PLCG1和RPS6KB1)，16个候选分子根据文献报道可以推测与Akt1具有功能相关性；14个候选分子和Akt1共享第四级及四级以上的GO分类；20个候选分子与Akt1有近似的基因敲除表型；30个候选分子的蛋白质序列含有Akt1保守的磷酸化位点。综合多种分析因素，我们进一步建立了一个综合评价体系并对每对候选相互作用的可信度进行评估，结果显示有36对候选相互作用为中高可信度。采用免疫共沉淀技术对其中6个候选蛋白质与Akt1的相互作用进行验证，结果表明5个分子(ANAPC2、MYLK2、PEX19、AIF和HEB)可与Akt1结合。对其中两对相互作用—Akt1/AIF和Akt1/HEB的功能进行了初步研究，结果表明活化的Akt1对凋亡刺激下的AIF核转位有抑制作用，这可能是Akt1调控细胞存活和抗凋亡的新作用机制；Akt1可在体外磷酸化HEB，并负调节其转录活性，HEB很可能是新发现的Akt1的作用底物。综上所述，应用我们所建立的TAP-MS技术体系纯化鉴定HepG2细胞的Akt1蛋白质复合体，获得的Akt1相互作用数据具有较高的可信度，揭示了一些新的参与P13K/Akt信号通路的分子，发现了新的可能调控Akt1活性的激酶，以及提出了30个具有多种生物学功能的候选Akt1的作用底物。这些新发现为进一步阐明Akt1的作用和调控机制提供了多个功能线索和候选分子，同时TAP-MS技术体系的成功建立，为开展胰岛素信号转导通路网络的蛋白质复合体等规模化研究奠定了基础。