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研究目的肾细胞癌(RCC)是最常见泌尿生殖系统的恶性肿瘤之一,其中约70%为透明肾细胞癌(ccRCC)。近1/3的ccRCC患者在诊断发生转移,预后不良。已发现长链非编码RNA LUCAT1在非小细胞肺癌和卵巢癌中发挥关键性作用。然而,对LUCAT1在ccRCC中的作用尚不明确。本研究旨在探讨LUCAT1在ccRCC中的作用。此外,我们旨在通过研究LUCAT1与miR-495-3p和SATB1的关系,寻找ccRCC中存在的LUCAT1-miRNA-mRNA的调控网络,揭示ccRCC的发生发展的分子机制。研究方法1)通过实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测包括64例ccRCC组织和20例正常肾组织中LUCAT1水平。TCGA数据库中下载448例ccRCC组织及67例正常肾组织LUCAT1表达数据。然后进行卡方检验分析LUCAT1表达与ccRCC患者的临床特征之间的关系,利用Kaplan Meier和Cox回归分析评价LUCAT1对ccRCC的预后价值。并利用ROC曲线评估LUCAT1对ccRCC的潜在诊断价值。此外,利用qRT-PCR检测不同人ccRCC细胞系(786-0,CAKI-1,ACHN)和人肾小管上皮细胞(HK-2)LUCAT1表达水平。2)通过转染LUCAT1特异性siRNA沉默ccRCC细胞株786-0和Caki-1中的LUCAT1,通过qRT-PCR证实siRNA敲除效率。然后,利用CCK8和EDU检测评价LUCAT1抑制对细胞增殖的影响。Matrigel侵袭实验探讨LUCAT1抑制对细胞侵袭能力的影响。另外,利用裸鼠移植瘤实验考察抑制LUCAT1对ccRCC体内生长的影响3)Targetscan生物信息学软件预测mir-495-3p和SATB1结合作用及位点。DIANA生物信息学软件预测miR-495-3p和LUCAT1结合作用及结合序列。利用双荧光素酶报告基因检测分析miR-495-3p和LUCAT1之间的结合作用及位点,4)并分析LUCAT1通过miR-495-3p调控SATB1表达的作用。为明确LUCAT1是否通过miR-495-3p发挥生物学功能,我们通过转染miR-495-3p inhibitor 抑制了 LUCAT1 敲除细胞 miR-495-3p 表达,通过 qRT-PCR验证miR-495-3p抑制率。然后利用CCK8法检测细胞增殖,Matrigel Transwell实验检测细胞侵袭。此外,利用qRT-PCR和Western blot方法检测SATB1表达,并通过皮尔森相关分析检验SATB1和miR-495-3p之间及SATB1和LUCAT1之间的相关性。研究结果1)验证标本中和TCGA数据均显示LUCAT1在ccRCC中表达显著上调。ROC曲线显示LUCAT1可作为ccRCC潜在的分子诊断标志物。TCGA数据中,LUCAT1高表达与肿瘤大小,远处转移和临床分期相关;验证标本中,LUCAT1高表达与肿瘤大小,临床分期,淋巴结转移及吸烟相关。Kaplan-Meier法分析发现,验证标本和TCGA数据中,LUCAT1高表达均与患者的不良预后相关。此外,多因素分析结果显示,验证标本中,LUCAT1高表达是ccRCC预后的独立风险因素。此外,在ccRCC细胞系786-0,Caki-1和ACHN中的LUCAT1表达均显著高于正常人近端肾小管上皮细胞系HK-2。2)CCK8法检测表明,LUCAT1 siRNA转染细胞在450 nm处的平均OD值均明显低于对照组。EdU实验表明LUCAT1 siRNA转染细胞的阳性细胞数较对照组显著减少减少。沉默LUCAT1显著降低ccRCC细胞的侵袭能力。另外,LUCAT1沉默后ccRCC裸鼠移植瘤的体积和重量均较对照度显著降低。3)DIANA预测发现miR-495-3p和LUCAT1存在结合位点。ccRCC组织中miR-495-3p表达显著低于正常肾组织。皮尔森相关分析显示ccRCC组织中miR-495-3p与LUCAT1存在负相关。进一步发现ccRCC中LUCAT1抑制后,miR-495-3p表达上调;但miR-495-3p过表达不影响LUCAT1表达。荧光素酶报告基因分析发现miR-495-3p可抑制mirGLO-LUCAT1-wt荧光素酶活性,但不影响pmirGLO-LUCAT1-mut荧光素酶活性。4)为明确LUCAT1是否通过miR-495-3p发挥生物学功能,我们进行恢复实验,即在LUCAT1敲除细胞中抑制miR-495-3p表达,我们发现LUCAT1敲除可显著抑制Caki-1和786-0细胞增殖,而miR-495-3p抑制可部分逆转细胞增殖减少;另外,我们发现LUCAT1敲除显着抑ccRCC细胞的侵袭,而miR-495-3p抑制可逆转细胞侵袭能力的降低。5)通过利用生物信息学分析软件TargetScan和DIANA预测发现,SATB1和LUCAT1拥有miR-495-3p相同的结合位点。然后,我们发现ccRCC组织中SATB1 mRNA表达显著高于正常肾组织,皮尔森相关分析显示ccRCC组织中miR-495-3p与SATB1负相关,SATB1和LUCAT1正相关。荧光素酶报告基因实验表明,miR-495-3p抑制pmirGLO-SATB1-wt荧光素酶活性,但不抑制pmirGLO-SATB1-mut的荧光素酶活性,敲除LUCAT1与miR-495-3p获得相似的结果。此外,ccRCC细胞中敲除LUCAT1可显著抑制SATB1表达,而抑制mir-495-3p表达后可部分逆转敲除LUCAT1对SATB1表达的抑制作用。研究结论1)ccRCC中LUCAT1表达异常上调,其异常表达可预测ccRCC的进展;2)ccRCC中LUCAT1作为癌基因,促进ccRCC的发生和进展;3)ccRCC中LUCAT1通过miR-495-3p-SATB1轴发挥促进ccRCC进展作用;4)LUCAT1可能作为一种ccRCC的生物标志物和潜在的治疗靶点。