【摘 要】
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目的:研究4SC-202作为一类组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(histone lysine-specific demethylase 1,LSD1)和I类组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)的新型靶点药物对骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞活力、凋亡和周期的影响,应用经典的分子生物学方法探讨4SC-202抗MDS
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目的:研究4SC-202作为一类组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(histone lysine-specific demethylase 1,LSD1)和I类组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)的新型靶点药物对骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞活力、凋亡和周期的影响,应用经典的分子生物学方法探讨4SC-202抗MDS的作用机制。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是一种抗凋亡的保护性蛋白,在MDS中高表达,与MDS危险分层和化疗耐药相关。因此,本课题同时也探讨HO-1对4SC-202抗MDS的影响。方法:临床样本:收集正常供者、22例新确诊的MDS和10例新确诊MDS向急性髓性白血病转化(MDS/AML)的患者标本,采用q RT-PCR、蛋白免疫印迹和细胞免疫化学的方法检测LSD1、HDAC3和HO-1的m RNA和蛋白质水平的表达情况。体外实验:用不同浓度和不同时间点4SC-202处理MDS细胞系SKM-1,采用CCK-8检测细胞活力,流式细胞术检测凋亡率和周期阻滞情况,q RT-PCR检测对LSD1、HDAC3和HO-1的m RNA水平的影响和蛋白免疫印迹检测LSD1、HDAC1/2/3、H3K4me2、AC-H3、HO-1、凋亡和周期相关蛋白和NF-κB通路相关蛋白的表达水平。荧光显微镜检测对P65的定位表达的影响。先用上调HO-1慢病毒Hemin(HO-1激活剂)和Zn PP(HO-1抑制剂)处理SKM-1细胞后,再用4SC-202处理24 h,采用CCK-8检测细胞活力、流式细胞术检测凋亡率和蛋白免疫印迹检测NF-κB通路相关蛋白的表达水平评价HO-1对4SC-202抗SKM-1的影响。用小干扰RNA传染沉默LSD1和HDAC3,蛋白免疫印迹考察NF-κB通路相关蛋白和HO-1蛋白表达水平。体内实验:在NOD/SCID小鼠中建立HO-1过表达模型与空载对照模型,流式细胞术分析小鼠体内外周血的人CD45~+含量,并绘制生存曲线。结果:收集的病人标本和正常人的标本相比,MDS/AML病人标本中LSD1、HDAC3和HO-1是高表达的。4SC-202处理SKM-1细胞后,SKM-1细胞存活率受到抑制、细胞凋亡率增加且细胞周期阻滞在G2/M期。4SC-202降低p-p65和p-IκB-α蛋白表达和抑制P65向细胞核内转移,从而抑制NF-κB通路的激活。4SC-202下调SKM-1细胞中HO-1的表达水平。直接沉默LSD1和HDAC3会下调p-p65、p-IκB-α和HO-1的蛋白水平。上调HO-1不会直接影响凋亡蛋白的表达、凋亡率和p-p65和p-IκB-α的表达,但显著性地降低4SC-202对凋亡蛋白和诱导细胞凋亡率的影响和对p-p65和p-IκB-α的下调水平。反之,Znpp可使4SC-202抗SKM-1细胞的效果增强。在异体移植的SKM-1细胞的NOD/SCID小鼠模型中发现,口服4SC-202处理组的小鼠生存率均高于未给药组。在用4SC-202处理的小鼠中,HO-1高表达组小鼠的生存率低于HO-1未上调组。结论:LSD1和I类HDACs的抑制剂4SC-202阻滞细胞周期在G2/M期和诱导细胞凋亡、抑制NF-κB通路的激活、下调HO-1的表达,从而抑制SKM-1细胞的增殖。上调HO-1减弱4SC-202抗SKM-1细胞的活性,但下调HO-1时加强4SC-202抗SKM-1细胞的活性。
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