犊牛腹泻是导致犊牛死亡的主要原因,尤其是断奶前的犊牛腹泻问题非常严重,不仅影响犊牛健康,还显著影响其后期生产性能的发挥,严重制约养牛业的发展。前人研究表明犊牛生命早期肠道微生物菌群对宿主长期健康起着至关重要的作用,而犊牛腹泻如何扰动肠道微生物菌群变化机理尚不清楚,而益生菌补充剂提供了改善犊牛早期肠道健康的机会,并在断奶前最大限度地减少犊牛对肠道感染的易感性。因此有效防治犊牛腹泻及促进犊牛胃肠道的损伤修复和健康微生物区系的形成,提高犊牛的成活率,是当前奶牛养殖迫切需要解决的问题,对推进犊牛健康、快速发展并提高犊牛的经济效益具有极为重要的现实意义。目的:本研究采用高通量测序技术探究E.coli K99感染的新生犊牛在不同时间段宿主肠道功能和微生物菌群的变化,探索与犊牛腹泻相关的主要差异微生物菌属。然后针对差异微生物菌属研制复合微生态制剂,评价复合微生态制剂对断奶前犊牛腹泻发生率、生长性能、免疫功能和肠道微生物菌群的影响;最后评价复合微生态制剂对缓解E.coli K99感染的新生犊牛肠道损伤调控机制的有效性,为复合微生态制剂在改善和提升犊牛的肠道健康提供了生产指导和科学依据。方法和结果:本论文由六个试验组成,具体研究方法和结果如下:试验一:E.coli K99感染对新生犊牛肠道微生物菌群、肠上皮发育和黏膜屏障功能的影响试验选取60头荷斯坦公犊牛,随机分为到2组,分别灌服无菌盐水（C组）和大肠杆菌悬浮液（D组,次日给予抗生素）,试验期为21天。分别于第7、14和21天采集血清、肠道内容物和组织黏膜。分析测定采食量、腹泻率、血清免疫、SIg A、小肠上皮结构及不同肠段的微生物区系,采用Pearson秩相关系数分析微生物与肠上皮发育和免疫球蛋白指数的相关性分析。本研究发现在d7、d14和d21时,D组空肠和回肠内容物中SIg A的浓度、绒毛高度、黏膜中GHR和INSR基因相对表达量显著低于C组;在第21天,D组空肠中Bifidobacterium,Lactobacillus,Prevotella＿7和Saccharomyces cerevisiae的相对丰度显著低于C组,D组空肠中Bacteroides和Apiotrichum的相对丰度有显著高于C组。因此,本研究证实肠道微生物菌群紊乱与肠道黏膜功能障碍存在关联。试验二:预防犊牛腹泻复合微生态制剂3株菌种的配比优化研究在试验一的基础上,通过研究嗜酸乳杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌在不同浓度人工胃液、肠液、牛胆盐的耐受性及其对E.coli K99、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性,确定其生物学特性;然后以E.coli K99为指示菌,研究3株益生菌不同配比对E.coli K99抑菌效果,确定最佳的配比组合。结果表明:3株益生菌在不同浓度人工胃液、肠液、牛胆盐中具有较好的耐受性;嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌最佳的优化配比为3:3:1。本研究为预防幼龄犊牛消化道疾病微生态制剂提供理论基础。试验三:复合微生态制剂对断奶前犊牛腹泻发生率、免疫功能和粪便微生物区系的影响本试验评估了不同剂量的复合微生态制剂（MSP）在WK2、WK4、WK6和WK8时对断奶前犊牛生长性能、腹泻发生率和免疫功能以及粪便微生物多样性和结构的影响。试验选取40头荷斯坦新生犊牛并随机分为4个处理组,每组10头,即:C（对照组）、T1（0.5 g/头/天）、T2（1g/头/天）和T3（2 g/头/天）组,试验周期为56天。每天记录牛只的采食量和粪便评分。在试验第WK2、4、6、8时,测定分析犊牛体尺、血清免疫、抗氧化指标以及粪便微生物菌群多样性和结构等,采用Pearson秩相关系数分析WK2时主要粪便微生物菌属与生长性能、血清免疫球蛋白浓度的相关性。结果表明:T3组出生前4周腹泻的发生率显著低于对照组、T1和T2组,同时提高了T3组在WK2和WK8之间的体高及血清中的T-AOC、Ig A、Ig G和Ig M浓度。与C组相比,补充MSP降低了T1和T2组中Bacteroides的相对丰度,并增加了T3组中在WK2时的Bifidobacterium,Lactobacillus,Collinsella和Saccharomyces的相对丰度。表明在犊牛断奶前四周添加复合微生态制剂MSP 2g/头/天是能够预防犊牛腹泻并提高其生产性能。试验四:研究复合微生态制剂对犊牛抗E.coli K99感染效果的影响试验选取新生犊牛40头,并随机分到两个处理2组（每组20头）。Ⅰ组为对照组（C组）、Ⅱ组饲喂MSP 2g/头/天（P组）,饲喂21天后,Ⅰ组和Ⅱ组分别灌服等量的生理盐水和E.coli K99悬浮液。测定分析生产性能和腹泻率、血清和直肠粪样中SIg A浓度。结果表明饲粮中添加复合微生态制剂可降低新生犊牛腹泻率、提高免疫性能和抗E.coli K99感染能力。试验五:复合微生态制剂对E.coli K99感染的新生犊牛生长性能和肠上皮发育的影响将36头犊牛随机分为三个处理组（每个处理12头）,分别为对照组（C组）,灌服无菌生理盐水;D组,灌服E.coli K99悬浮液（次日给予抗生素）;P组,灌服E.coli K99悬浮液并于次日饲喂MSP 2 g/d,试验期为21天。采集生长性能、血样、肠道组织用于分析腹泻发生率、血清和肠道免疫（Ig A、Ig G等）相关参数。结果表明:补充MSP可以提高受E.coli K99感染的新生犊牛的ADG,增强肠道的营养消化吸收能力和调节肠道能量代谢,有助于改善和修复E.coli K99感染犊牛肠上皮结构。试验六:复合微生态制剂对E.coli K99感染犊牛肠道黏膜屏障功能和菌群区系的影响本部分的试验设计同试验五。采用高通量测序和宏蛋白组学结合的方法分析探索肠道微生物菌群改变与宿主肠道黏膜屏障功能之间的互作。结果表明:（1）添加MSP相较与D组显著改变了感染后第21天小肠的真菌Chao1（丰富度）、Shannon（多样性）和后肠道菌群多样性。（2）添加MSP相较与D组显著提高了十二指肠和空肠Firmicutes和Actinobacteria相对丰度和显著降低了空肠中的Bacteroidetes的相对丰度（P=0.03）。同时显著提高了P组空肠中Bifidobacterium、Prevotella＿7、Ascomycota、Saccharomyces的相对丰度（P＜0.01）。（3）P组十二指肠、空肠和回肠黏膜中SIg A浓度显著高于D组（P＜0.01）;P组空肠黏膜IL-1β、TLR4、ZO-1和occludin m RNA相对表达量和空肠中总SCFA浓度显著高于C和D组（P＜0.01）;（4）补充MSP通过降低HSP90的表达,显著增强感染E.coli K99的犊牛的肠道能量代谢和防御机制,从而减轻炎症反应,促进肠道黏膜功能的恢复。结论:（1）犊牛感染E.coli K99后使用抗生素会扰乱肠道免疫及黏膜屏障功能,引起不同肠段的微生物多样性和结构发生巨大变化,具有降低Firmicutes与Bacteroidetes比值的趋势。在感染后第21天,犊牛空肠中细菌和真菌菌群结构和多样性发生了改变,表现为Bifidobacterium,Lactobacillus,Prevotella＿7和Saccharomyces cerevisiae的相对丰度降低,Bacteroides和Apiotrichum的相对丰度增加。（2）三株益生菌对E.coli K99具有较为明显的抑制作用,最佳比例L.acidophilus:B.subtilis:S.cerevisiae为3:3:1。（3）MSP能够有效调节和优化断奶前犊牛的肠道微生物区系,MSP最适添加量为2g/头,最适添加时间为犊牛生命前四周。具有提升犊牛肠道中Firmicutes与Bacteroidetes比值的趋势,而犊牛腹泻发生率较低是肠道微生物组成和多样性的影响的结果。（4）MSP的添加能够通过调节不同肠段微生物的多样性和结构来激活感染E.coli K99犊牛的肠道能量代谢机制和防御机制,提升宿主消化吸收功能、免疫功能和肠道黏膜屏障功能,实现了缓解炎症反应促进黏膜功能的恢复作用。