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本项研究以无基质血红蛋白(Hb)的化学修饰作为红细胞代用品的研究途径,以聚乙二醇(PEG)修饰Hb作为研究模式,旨在解决Hb偶联相关问题。内容包括:以生物信息学和量子化学的方法确定血红蛋白的修饰方式与修饰部位,以生物化学方法完成血红蛋白的分离纯化及修饰产物的制备,在此基础上进行相关修饰产物的理化性质、结构与生物学功效的研究。 用结构分析和分子模拟方法对牛与猪血红蛋白(bHb/pHb)的结构与表面性质进行了分析,并模拟了聚乙二醇(PEG)通过选择性连接物与血红蛋白偶联后对其结构及携氧功能的影响。结果表明,bHb与pHb与二聚体中分别有12个和13个赖氨酸残基的氨基具有较高反应活性,可以作为进行修饰部位,与5KD的PEG-Linker形成的共轭物将大于64KD,但不影响血红蛋白的携氧功能。 确立了一个简便的血红蛋白纯化方法及其纯度检测方法,完成了牛、猪、人血红蛋白的分离纯化。电泳结果表明,纯化产物以32KD的二聚体形式存在,其均一性较高。纯度检测结果表明,纯化产物中未见明显磷脂与核酸,其红细胞标志酶的活性亦低于人血清。拉曼光谱和全波长扫描证实Hb纯化产物空间结构与标准Hb相似,携氧功能未受影响。 以一定比例的血红蛋白纯化产物与PEG(5000)-Linker组成反应体系,在特定条件下完成偶联反应。电泳和三硝基苯磺酸显色结果表明,相当数量的PEG分子能与血红蛋白二聚体特异偶联,且60%以上偶联产物大于64KD。以全波长扫描方法分析血红蛋白的光谱特性,发现偶联产物波形改变。确立了PEG-Hb共轭物分离纯化条件,即通过DEAE-Spbarodex可纯化成成单一组分。 利用失血性休克大鼠模型对偶联产物的毒性和携氧扩容功能进行了检测,结果表明偶联产物未表现出急毒性,并能使休克大鼠的血压和心率恢复到一定程度。