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老年痴呆症中最常见的为阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD),它严重影响了患者的认知功能、记忆功能、个人及社会生活能力等。目前,关于AD病理较为接受的为“胆碱能缺失学说”,认为大脑内神经递质—乙酰胆碱的缺失是导致AD的关键原因,故对AD的治疗主要是采用乙酰胆碱酯酶抑制剂,如他克林、加兰他敏、石杉碱甲等,通过抑制乙酰胆碱脂酶,提高患者体内的乙酰胆碱水平,延缓乙酰胆碱的水解速度,发挥治疗作用。但目前的药物价格较贵,且具有一定的副作用,化学合成新的药物难度大,故天然产物药物的开发与研究成为研究的重点。海洋微生物生活环境较为特殊,代谢途径独特,因而具有多种生物活性。因此,本文采集海洋野生的动植物,分离其内生真菌,以乙酰胆碱酯酶的抑制率为指标,进行活性菌株的筛选及鉴定,优化液体发酵条件,并分离发酵液中的活性次生代谢产物,采用波谱学的方法分析鉴定其结构。本文研究的内容及结果如下:
1.海洋生物内生真菌的分离及抗老年痴呆活性菌株筛选、鉴定
以长岛海域9种海洋动物、植物为原材料,对其内生真菌进行分离、纯化,分离出的内生真菌进行液体发酵,并采用DTNB显色法测定各菌种发酵液抑制乙酰胆碱酯酶活性,筛选具有活性的菌株,并对其中活性最高的一株菌株Pt-2进行形态学和分子生物学的鉴定,确定菌株种属。
实验结果表明,从长岛海域采集到的9种生物中分离获得内生真菌42株,具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的33株,其中Pt-2菌株的发酵液活性最高,抑制率为65.12%。该菌种经鉴定为芽枝霉属,命名为Cladosporiumsp.Pt-2。
2.Cladosporiumsp.Pt-2菌株液体发酵条件的优化
以发酵液AchE抑制率为活性指标,采用单因素和正交试验对发酵时间、接种量、装液量、培养温度和碳源、氮源等发酵条件进行优化。最终得出其最佳发酵条件为发酵时间9天、接种量5%、装液量200mL(每500mL三角瓶)、培养温度25℃,碳源为葡萄糖,氮源为酵母膏。在此条件下,发酵液提取物的乙酰胆碱酯酶抑制率较高,为76.32%。
3.Cladosporiumsp.Pt-2发酵液中抑制AchE活性物质的分离
发酵液经乙酸乙酯萃取后,采用硅胶柱层析、反相柱层析、凝胶柱和高效液相等色谱学的方法进行分离,分离得到组分1、2和3,通过波谱学的方法进行结构测定。最终化合物1确定为环(缬-亮)二肽,化合物2确定为环(酪-亮)二肽,组分3经GC-MS分析可能含有5个化合物,分别为3-1甲基睾酮,3-2二苯硫醚,3-3硬脂酸甲酯,3-418-碳烯酸甲酯,3-52-乙基-1-己醇。