膀胱癌为泌尿系统最常见的肿瘤，在全世界范围内，每年诊断病例达2600,000例，其中3.2％为新发病例。2002年，美国预测54,000例新发病例，12,000例死亡病例，位居男性肿瘤发病率的第9位，在女性为25位。在我国，男性膀胱癌占全身肿瘤的第8位，在女性占12位以后。世界范围内临床与病理学因素预测肿瘤的发生与进展已经广泛展开。随着分子生物学的发展及其在肿瘤中的应用，现在认为肿瘤发生机制主要是原癌基因的激活和抑癌基因的失活导致细胞增殖失控及凋亡缺陷。所以，肿瘤被视为一种基因疾病。纠正肿瘤细胞中异常基因的行为，抑制癌基因的过度表达，增强抑癌基因的功能，将从分子水平治疗肿瘤。膀胱肿瘤在人类肿瘤中可能表现为的两种不同肿瘤发生途径。第一条途径于1993年发现，为肿瘤抑制基因TP53的改变。TP53基因突变共同的生物学作用为使蛋白的转录活性失活，从而进行细胞周期的调节、诱导凋亡及DNA的修复。p53定位于17q13.1，全长近20kb，共有11个外显子和10个内含子，转录产物为2.5 kb的mRNA，编码一个53 KD含有393个氨基酸的蛋白。p53蛋白对维持细胞正常生长及分化起到核心作用，也是化学致癌物质攻击的主要靶基因，从而成为肿瘤中发生突变的常见基因。其突变热点存在于第5、6、7、8外显子等片段。第二条路径为最近倍受关注的FGFR3基因的突变。FGFR3基因为跨膜的酪氨酸蛋白激酶受体家族之一，基因定位于人类染色体4p16.3，长约16.5kb，有19个外显子和18个内含子组成。FGFR3的cDNA有4.4kb，可译框架有2520个核苷酸，编码840个氨基酸组成的蛋白。4p16.3的LOH可见于22％的膀胱肿瘤患者，表明一个肿瘤抑制基因可能存在于这个区域。体细胞FGFR3基因突变多见于表浅的乳头状膀胱肿瘤，膀胱肿瘤中的FGFR3突变热点存在于第7、10、15外显子片段。有证据的积累表明FGFR3突变的激活而不是基因扩增在膀胱肿瘤的发生中发挥作用。迄今为止，膀胱肿瘤中已经发现了8个被证实的点突变。本研究通过免疫组织化学染色检测FGFR3及p53蛋白在膀胱肿瘤组织中的表达，初步研究了蛋白水平上FGFR3及p53与膀胱肿瘤发生及预后的关系。目前国内外对此尚缺乏大量的病例研究。对FGFR3及P53基因突变的检测，我们采用了目前世界上最为流行与高效的变性高压液相(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)对扩增的基因外显子产物进行筛选后，进行DNA测序，检测FGFR3及P53基因各外显子突变的情况。对进一步探讨FGFR3及P53基因突变在膀胱肿瘤发生及其临床生物学行为等方面的研究奠定了基础。第一章膀胱移行细胞癌组织中FGFR3、p53及Ki-67蛋白的表达及其与膀胱癌预后的关系目的：探讨膀胱移行细胞癌(Bladder transitional cell carcinoma,BTCC)组织及正常膀胱粘膜组织中成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3)、p53及Ki-67蛋白表达情况，同时分析FGFR3、p53及Ki-67的表达与临床病理参数之间的关系及其相互之间的相关性，初步揭示BTCC发生、发展的分子机制，为进一步探讨膀胱肿瘤的发生发展奠定了基础。方法：应用免疫组织化学方法检测不同病理分期及组织分级的BTCC标本和正常膀胱粘膜中FGFR3、p53及Ki-67蛋白的表达情况；Ki67蛋白结果计算标记指数值(labeling index,LI)。另外应用免疫蛋白印迹检测FGFR3在不同组织中的表达情况。探讨BTCC组织中FGFR3、p53及Ki-67蛋白的表达之间的关系及三者与各临床病理学参数之间的关系。结果：免疫组织化学结果显示，FGFR3表达阳性率在膀胱移行细胞癌中为54.6％(59／108)，而正常膀胱粘膜组织FGFR3无表达，两组间差异有显著性(P＜0.05)，且FGFR3的表达率与膀胱癌的分级和分期密切相关(P＜0.01)。p53在移行细胞癌组及正常膀胱粘膜中的表达率分别为40.7％(44／108)和0(P＜0.01)，且随着组织病理学分级的增高，p53蛋白阳性表达率呈增高，p53蛋白阳性表达率在各级间有显著差异(P＜0.01)；另外，p53蛋白在浸润性BTCC中的阳性表达率明显高于表浅性BTCC，二者间差异有显著性(P＜0.01)。膀胱癌中Ki-67 LI的表达平均为21.9±11.7。正常组织中不表达。Ki-67表达与膀胱癌分期分级有关，Ki-67 LI G3明显高于G1和G2(P＜0.01)，且与分期密切相关(P＜0.05)在western-bolt检测结果中，8例肿瘤组织中均有FGFR3表达，4例正常粘膜中FGFR3仅有1例弱表达，各组间的差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论：1．FGFR3、p53及Ki-67蛋白表达与膀胱癌的分期分级密切相关，是膀胱癌的诊断与预后极有价值的指标。2．FGFR3在低分级表浅膀胱肿瘤中表达率高，而p53则多表达于高分级的浸润性肿瘤，提示二者可能介导了两条不同的膀胱肿瘤的预后通路。第二章膀胱移行细胞癌组织中FGFR3、P53基因突变与预后关系的研究目的：探讨BTCC组织及正常膀胱粘膜组织中FGFR3及P53基因突变的表达情况，同时分析FGFR3、P53突变的表达与临床病理参数之间的关系及相关性，初步揭示BTCC发生、发展的分子机制，为进一步探讨膀胱肿瘤的发生发展奠定了基础。方法：应用变性高压色相分析(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)及PCR产物直接测序的方法检测不同病理分期及组织分级的BTCC标本和正常膀胱粘膜中FGFR3及P53基因突变的情况；FGFR3及P53基因突变与肿瘤复发的预后关系采用Kaplan-Meier生存分析，无复发生存率用Log-rank检验结果差异是否有显著性。探讨BTCC组织中FGFR3及P53突变与膀胱肿瘤临床病理参数之间的关系。结果：对98例膀胱癌患者组织提取的基因组DNA，PCR分别扩增出P53基因外显子Exon5、6，Exon7和Exon8，FGFR3基因外显子Exon7、Exon10、Exon15等目的条带。对PCR产物进行DHPLC的初步筛选。经过DNA测序发现FGFR3突变44例(44.9％)，P53突变34例(34.6％)。在FGFR3突变检测中，44例中存在6种突变。突变见于7、10、15号外显子。其中11例突变为转换，33例为易位颠换。而在P53突变检测中，我们发现98例患者中的34例中存在9种突变。突变见于5～8号外显子。20例突变为转换，14例为易位颠换。FGFR3和TP53突变对膀胱肿瘤预后的研究中，Kaplan-Meier生存分析显示：FGFR3突变组较未突变组有较长的复发间隔，无复发生存率用Log-rank检验结果P＜0.05，差异有显著性。P53突变组较未突变组复发间隔较短，无复发生存率用Log-rank检验结果P＜0.05，差异有显著性。当按照FGFR3和TP53突变的基因型进行分类，比较FGFR3mut／TP53wt、FGFR3wt／TP53wt及FGFR3wt／TP53mut三种基因型与膀胱肿瘤预后的关系。Kaplan-Meier生存分析结果显示：FGFR3mut／TP53wt组较其他两组存在较长复发间隔，无复发生存率用Log-rank检验结果P＜0.05。其他两组之间无显著性差别。结论：1．FGFR3、P53基因突变与膀胱癌的临床分期分级密切相关，是膀胱癌的诊断与预后极有价值的指标。2．FGFR3突变多见于低分期分级的膀胱肿瘤，提示了一条膀胱肿瘤较好的预后通路。3．P53突变多见于高分期分级的膀胱肿瘤，提示了一条膀胱肿瘤较差预后通路。4．从FGFR3和TP53突变的基因型进行分析，FGFR3mut／TP53wt组提示了较长的复发时间，膀胱肿瘤较好的预后。但二者是否存在交叉作用，尚需进一步的研究来证实。FGFR3mut／P53wt等基因型分析对早期膀胱肿瘤治疗方式的选择具有潜在的价值。第三章膀胱移行细胞癌中p53突变蛋白三维空间结构的预测目的：通过研究膀胱肿瘤中p53基因突变及其蛋白三维结构的改变，探讨P53探讨抑癌基因p53在BTCC中发生发展的作用，旨在为预测、控制并改造p53蛋白质的结构提供一些理论依据。方法：应用DNA序列分析以及SWISS-MODEL等相关分析软件重构蛋白三维结构等技术对膀胱肿瘤中P53突变的结构改变进行研究。结果：p53蛋白三维空间结构的改变是BTCC发生发展的分子病理学基础，p53位于核心功能域的DNA结合位点突变或缺损可引起P53蛋白DNA结合位点的改变或丢失，使P53蛋白结合靶DNA的活性部分甚至完全消失，使细胞产生恶性转化。同时这种突变型P53蛋白还能与野生型P53蛋白结合使其失活，进一步诱发肿瘤的发生和发展。结论：在膀胱移行细胞癌的发生发展过程中P53蛋白的三维结构改变起着十分重要的作用。