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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒甲亚科水痘疱疹病毒属，分类学命名为猪疱疹病毒Ⅰ型。PRV能引起仔猪出现神经症状、死亡，母猪流产、弱胎、死胎，育肥猪食欲下降、增重缓慢等现象，给世界各国养猪业带来巨大经济损失。猪伪狂犬病的防控主要依赖于疫苗的使用，尤其是基因缺失疫苗的应用。我国自1948年首次发现PRV以来，通过广泛使用PRV疫苗有效控制了疫情。但是近几年，部分免疫过的猪场却出现疑似猪伪狂犬病的症状。 本研究收集浙江一免疫猪场的疑似患病仔猪脑组织病料，将病料经无菌研磨处理后接种Vero细胞进行病毒分离。结果显示，病料接种Vero细胞后36 h出现细胞圆缩、折光性增强、细胞脱落等现象。分离物经PCR鉴定、蚀斑纯化以及电镜观察确定为伪狂犬病毒，命名为DX株。遗传进化分析显示，DX株gE序列与近期国内一些免疫猪中分离到的野毒株序列相近，而与一些欧洲分离株距离较远。相应的gE基因序列推导的氨基酸序列分析结果表示，DX株与早前分离到的毒株比较明显的区别即在48位有天冬氨酸(D)的插入，54位(G＞D)、448位(V＞I)、492位(G＞D)、551位(G＞S)均有突变。相应的gB和gC基因氨基酸分析结果显示，新流行毒株与先前分离株相比分别有3个氨基酸缺失和7个氨基酸的插入。小鼠致病性实验结果显示，DX株LD50(104.00TCID50)要略弱于经典强毒株SC株的LD50(103.32TCID50)，家兔感染后也呈现典型的PRV感染症状。 通过高通量测序平台Hisq2000和PCR补足，我们获得了DX株141660bp的基因组序列，其基因组GC含量73.6％(C37％，G36.6％)。与经典的Kalplan株、Becker株、Bartha株相似，DX株基因组含69个开放阅读框，但编码的许多重要糖蛋白发生了氨基酸变异、插入、缺失现象。如，与宿主免疫相关的gC在63-69位有7个aa插入，类似功能的gD糖蛋白在280-281位缺失RP;比较保守的gB糖蛋白与Bartha株相比在75-77位连续缺失3个氨基酸，313位变异(V＞M);与胞间传播相关的gN在49位变异(A＞T)。主要毒力基因TK无明显重大变异。与病毒在宿主体内的早期有效转录密不可分的基因IE180，出现了99位(P＞Q)、100位(R＞Q）、176位(S＞P)、460位(A＞S)的变异;被膜蛋白中变异较大的是UL13，出现了28-34位7个aa的连续缺失;外膜蛋白中的UL20则在7、19、20、21位出现了氨基酸的插入。进化树分析显示，DX株与中国最近的流行株均处于一个相对独立的分支。 我们利用Cre/loxp系统构建了两个用于敲除gE和TK基因的转移载体:PUC18-gEloxpCherry、PUC18-TKloxpEGFP。通过亲本株基因组DNA与PUC18-gEloxpCherry质粒的共转染、蚀斑纯化，我们得到一株缺失了gE主要抗原区域883 bp的gE-单基因缺失株，并通过相同的方法获得了一株缺失TK主要保守基因330 bp的TK-单基因缺失株。在PRV DX gE-的基础上，将其基因组DNA与PUC18-TKloxpEGFP共转染，再经Cre重组酶处理以及蚀斑纯化最终获得了gE-/TK-双基因缺失株。对gE-单基因缺失株、TK-单基因缺失株以及gE-/TK-双基因缺失株、亲本株PRV DX的滴度进行测定，发现其细胞适应毒在Vero细胞上的滴度分别为10-7.25TCID50/0.1 ml、10-7.15TCID50/0.1 ml、10-7.28TCID50/0.1 ml、10-7.35TCID50/0.1 ml，说明gE或TK的缺失并不影响病毒在Vero细胞上的增殖。将DX株、gE-单基因缺失株、TK-单基因缺失株、gE-/TK-双基因缺失株分别接种小鼠及家兔，发现gE-单基因缺失株和TK-单基因缺失株的毒力略有所下降，而双基因缺失株对动物的毒力明显下降。