鸭疫里默氏杆菌(RA)病和大肠杆菌(E.coli)病是危害养鸭业的两大主要细菌性传染病。在临床上常以混合感染的形式出现,死亡率高,饲料转化率低,治疗代价高,给养鸭业造成极大的经济损失。本研究对鸭疫里默氏杆菌病和大肠杆菌病的病原学、流行病学、诊断方法和灭活苗进行研究,取得了如下成果:　　 1.广东地区RA与鸭源E.coli的分离鉴定及生物学特研究通过对广东不同地区鸭疫里默氏杆菌病和大肠杆菌病发病情况的调查,并根据临床症状、剖检结果、实验室的细菌分离、纯化、鉴别培养、牛化试验、药敏试验、玻板凝集试验、琼脂扩散沉淀试验以及回归动物试验等检测,证实了广东省鸭疫里默氏杆菌病和致病性大肠杆菌菌病流行严重性。分离到的50株RA菌株和50株鸭源E.coli菌株,一部分具有很强的致病性。选用了25种抗菌药物对分离到的RA菌株和鸭源E.coli菌株进行药敏试验,结果表明,RA菌株和鸭源E.coli菌株耐药谱很广,多重耐药的问题越来越突出。本实验室对所有的RA菌株和鸭源E.coli菌株通过玻板凝集试验和琼脂扩散沉淀试验进行血清型调查,结果表明广东地区2008至2011年RA血清型以2型为丰型,占52.00％,其次是1型,占18.00%,此外还有15株未定型RA有待进一步检测,占30.00%:鸭源E.coli菌血清型以078为丰型,占72.00%,其次O2型,占14.00%,再次O1型,占6.00%,此外其他血清型占8.00%。该结果为广东省对于鸭疫里默氏杆菌病和大肠杆菌病的预防与控制措施的制定提供了科学依据。　　 2.RA普通PCR快速检测方法的建立根据鸭疫里默氏杆菌16SrRNA基因的保守序列设计特异引物,对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌进行检测,只有鸭疫里默氏杆菌的DNA能扩增出672bp的特异条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带;将RA的基因组DNA和菌液进行梯度稀释,并进行PCR扩增,结果RADNA最小检出量为1.907×10-5g/L,RA菌液最少检出量为1.5×104CFU/mL;对用传统方法分离鉴定的22株RA进行检测,均可以扩增出672bp的目的条带,与传统方法的符合率100%;通过16SrRNA系统进化分析进一步证实分离株RA-gd9、RA-gd10、RA-gdl8、RA-gd21、RA-gd33确实为鸭疫里默氏杆菌。本试验在传统分离方法的基础上,应用16SrRNA同源识别验证,总结出一套简化的鸭疫里默氏杆菌鉴定方法,为鸭疫里默氏杆菌的快速鉴定提供基础。　　 3.荧光定量PCR检测RA标准品质粒的制备该研究的目的是克隆出含扩增片段的质粒,并比较该细菌与已发表序列的相似性。提取鸭疫里默氏杆菌DNA作为模板,利用设计的特异性引物进行PCR扩增,结果只有以RA为模板才可以扩增出379bp的特异条带。纯化产物与pMD18-T连接,连接产物转化感受态细胞DH5a,经氨苄抗性筛选和PCR鉴定后,进行测序。结果表明该克隆出的扩增片段基因序列与Genbank公布的序列有100%的相似性。该克隆成功为荧光定量PCR检测标准曲线的绘制提供了阳性质粒。　　 4.RA荧光定量PCR检测方法的建立根据鸭疫里默氏菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。该方法只对RA DNA有阳性扩增信号,对鸭源的大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌均无特异性反应,这表明具有高度特异性。该方法的表达式Ct=-3.676×1g copies+45.17,相关系数R2=0.996,R循环效率Eff%=93.482,DNA拷贝数在100～108范围内检测曲线有良好的线性关系,对质粒标准品最低检测限为1.0×101拷贝/μL,比普通PCR的敏感性强100倍,重复性检测的变异系数低于5%,这说明所建立的FQ-PCR方法具有稳定性和重复性,标准曲线相对理想,具有较好的实用性。　　 5.RA和鸭源E.coli的微量凝集检测方法的建立建立的微量凝集试验(Microagglutination test,MAT)方法检测鸭血清中的RA和E.coli抗体特异、快速,敏感,成本低。MAT抗原为灭活的RA和E.coli菌体抗原,浓度以A600分别为1.429和0.987时为优。V型微量反应板中,反应体积为100μL,50μL血清用50μL PBS稀释后进行倍比稀释,加.Z,50μL抗原,37℃反应4h。阴性孔中央有白色沉淀点,当板垂直树立时,沉淀点向下滑成线状;阳性孔中无沉淀点,板垂直树立时无下滑线现象。采用该方法分别对RA2型和E.coli O78阳性血清的检测结果均为阳性;RA-gd9株凝集抗原与RA1型阳性血清、鸭病毒性肝炎(DVH-1)阳性血清、鸭瘟(DVE)阳性血清、E.coli O1、O2和O78阳性血清的反应均为阴性:E-gd7株凝集抗原除了与RA1型阳性血清、RA2型阳性血清、鸭病毒性肝炎(DVH-1)阳性血清、鸭瘟(DVE)阳性血清、E.coli O1阳性血清和E.coli O2阳性血清的反应均为阴性,具有良好的特异性。该方法均能够检测RA抗体和E.coli抗体的滴度为1:512,具有良好的敏感性。按本方法制备的凝集抗原试剂保存期达6个月。本研究为RA和鸭源E.coli的抗体检测提供了一个简捷、灵敏和特异的方法。　　 6.鸭疫里默氏杆菌一鸭源大肠杆菌二联油乳剂灭活苗的研究6.1 RA-E.coli二联灭活疫苗研制及疫苗菌株的筛选根据本课题组完成的RA和鸭源E.coli的流行病学调查结果,以广东省最流行的RA血清2型和E coli O78型菌株研制疫苗,通过对临床资料及动物试验结果的比较筛选出毒力强,免疫原性好的菌株即血清2型RA-gd35株和血清O78型E-gd21株作为疫苗候选株,毒力稳定性和免疫原性试验结果表明两菌株分别连传M代和N代后仍保持稳定,因而最终确定这两株菌作为RA-E.coli二联灭活疫苗制备与检验用菌株。　　 6.2 RA-E.coli二联灭活疫苗基础菌种的研究按照《中国兽用牛物制品质量标准》要求建立用于二联灭活疫苗制备与检验用的基础种子,对基础菌种的形态、培养特性、生化特性、血清型、毒力、免疫原性、毒力稳定性和免疫原性稳定性等进行研究。结果表明两种基础菌种在各个方面均符合它们的特征,RA-gd35株为血清2型,E-gd21株为血清O78型,基础菌种纯粹检验无杂菌生长,RA-gd35菌种传代M(实为明确代数,考虑到研究成果的保密性,以“M”代替)代以及E-gd21菌种传代N(实为明确代数,考虑到研究成果的保密性,以“N”代替)代以后的毒力和免疫原性均保持稳定不变,在各方面完全符合基础菌种的要求。　　 6.3 RA-E.coli二联灭活疫苗的安全性试验在实验室试制五批RA-E.coli二联灭活疫苗,批号分为0501、0502、0503、0504、0505。通过对最小使用日龄靶动物接种、各种接种途径一次单剂量接种,对靶动物单剂量重复接种,对靶动物一次超剂量接种以及接种后观察精神状态、食欲和体温等指标对疫苗进行安全性评价,结果表明该疫苗安全且无副作用。　　 6.4 RA-E.coli二联灭活疫苗的效力检验通过动物试验对试制的第0502批次二联灭活苗进行效力检验。选用10日龄的雏鸭进行首免颈部皮下免疫10只雏鸭,在免疫21日连同条件相同的对照组分别用RA-gd35株和E-gd21株进行攻毒试验,结果免疫保护率在70%以上;另用第0502批次二联灭活苗首免21日后二免,二免后14日进行攻毒试验,结果免疫保护率在90%以上。　　 6.5 RA-E.coli二联灭活疫苗的免疫期及抗体消长规律试验本研究测定了1次免疫和2次免疫雏鸭体内抗体水平的消长规律,并根据测定的结果来确定二联灭活疫苗免疫持续期,进而确定最佳的免疫程序。选择第0502批次二联灭活苗对10日龄雏鸭进行免疫,在首免21日后进行二免,分别于首次免疫后第7、14、21、28、35、42、49、56、63日采血,用微量凝集试验检测抗体。结果2次免疫后RA的抗体和E.coli的抗体比1次免疫后的抗体水平高,且维持时间长。故推荐种蛋鸭的免疫程序为,雏鸭首免21天后在进行二次免疫,这样鸭体内能长时问维持高水平的抗体。　　 6.6 RA-E.coli二联灭活疫苗的保存期试验本室制备五批灭活疫苗分别存放在4℃阴暗处保存15个月和25℃保存6个月均没有出现破乳、分层和沉淀现象。4℃和25℃保存的五批疫苗在不同保存期分别以0.5mL对雏鸭进行免疫,每组免疫雏鸭,分别在免疫后21日采血,检测其微量凝集抗体效价,结果表明不同条件和不同温度下保存的疫苗免疫雏鸭的RA微量凝集抗体效价均在410g2以上,而E.coli微量凝集抗体效价均在510g2以上。将4℃保存15个月和在25℃保存6个月的疫苗随机抽取一批对10日龄雏鸭进行免疫,二免后14日连同条件相同的对照组分别用RA-gd35株和E-gd21株进行攻毒试验,试验结果表明在4℃保存15个月和在25℃保存6个月的疫苗能对雏鸭的提供足够的保护力,符合疫苗效力检测的标准。