论文部分内容阅读
水稻四号染色体测序采用了以物理图为基础的克隆连克隆战略。通过构建BAC克隆重叠群，可以构建覆盖整条染色体的精细物理图。当一个BAC克隆被测序并被确定了在染色体上的位置，该克隆就可以被用作种子BAC去鉴定相邻的候选BAC克隆。
本研究采用了两种方法来延伸四号染色体重叠群：(1)纤维素膜BAC克隆点杂交法。以种子BAC末端序列为模板，通过PCR扩增获得分子探针；(2)STC战略。通过比较数据库中的不同BAC末端，进而快速确定BAC间的关系。通过这些方法，实现了克隆重叠群的延伸，并最终构建了粳稻的精细物理图。高等植物、原生生物和真菌中都具有两条呼吸途径，即细胞色素途径和选择性氧化酶途径。线粒体选择性氧化酶是对氰化物不敏感而对水杨基羟肟酸敏感的末端氧化酶。相比较细胞色素途径，选择性氧化途径是能量浪费的通路，这一途径首先在产热植物中被发现。然而到目前为止，选择性氧化酶在非产热植物如水稻中的功能仍然不清楚。水稻选择性氧化酶基因OsAOXla和OsAOXlb以串联重复的形式位于水稻四号染色体上。本研究首先利用Red系统敲除了大肠杆菌的hemA基因，得到了不能在LB培养基上面生长的大肠杆菌突变株。为了鉴定水稻选择性氧化酶的功能，我们利用构建的OsAOXla和OsAOXlb原核表达载体去转化大肠杆菌突变株，并证明OsAOXla和OsAOXlb都能互补大肠杆菌hemA-突变株。多序列比对分析发现，在一些选择性氧化酶基因家族成员中，两个保守的半胱氨酸位点有的被丝氨酸替代。在单子叶植物中发生丝氨酸替代保守半胱氨酸的情况只出现在OsAOXlb组中。OsAOXlb的两个保守半胱氨酸位置都发生了天然的替代，被丝氨酸所取代。通过定点突变，分别得到了OsAOXlf、OsAOXls、OsAOXld的表达载体，分别是在OsAOXlb的第一个或第二个位点被半胱氨酸替代，或者是两者都被半胱氨酸取代。我们发现OsAOX1f和OsAOX1d的转化可以让大肠杆菌突变株在LB平板上生长，而用OsAOX1s转化大肠杆菌突变株，后者生长较差。我们还构建了GFP融合的OsAOX1a和OsAOX1b转化酿酒酵母，在荧光显微镜下观察荧光，结果显示OsAOX1a和OsAOX1b在酵母中定位到线粒体中。次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)是鸟嘌呤核苷酸合成途径中的限速酶。在NAD作为辅酶存在下，IMPDH催化从IMP到XMP的反应。因此它在提供鸟嘌呤核苷酸合成DNA和RNA中发挥重要作用。在数据库中BLAST搜索和序列分析发现水稻中的IMPDH基因位于第三号染色体上并具有两个选择性剪切而来的转录本：OsIMPDH1a和OsIMPDH1b。OsIMPDH1a有四个外显子，而OsIMPDH1b只有三个外显子且其翻译终止密码子位于OsIMPDH1a的第三个内含子中。在本研究中，我们通过RACE克隆的方法获得了OsIMPDH1a的全长cDNA。推测的OsIMPDH1a和OsIMPDH1b蛋白分别有501个氨基酸残基和492个氨基酸残基。通过RT-PCR考察了OsIMPDH1a和OsIMPDH1b在籼稻中的表达显示，OsIMPDH1a在检测的组织中是组成型表达的，而且相对于OsIMPDHlb是主要的转录产物。为了进一步鉴定OsIMPDH1a和OsIMPDH1b的功能，我们构建OsIMPDH1a和OsIMPDH1b的真核表达载体转化酵母突变菌株(DY887)，这一菌株由于细胞内的四个IMPDH基因都被敲除导致不能在YPD和SD培养基上生长。结果显示除了酿酒酵母本身的内源基因可以互补，OsIMPDH1a和OsIMPDH1b并不能互补DY887菌株。同时构建了OsIMPDH1a和OsIMPDH1b的原核表达载体转化大肠杆菌guab突变株，通过Western blotting证明OsIMPDH1a和OsIMPDH1b都在大肠杆菌中表达。在酵母细胞中GFP融合的OsIMPDH1a和OsIMPDH1b的表达证明二者定位在酵母细胞质中。