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[目的]：制备嵌合乙型肝炎病毒(HBV)优势表位的病毒样颗粒(VLP)和生物佐剂与HBsAg共价偶联疫苗制剂两个思路探索解决现行疫苗在预防和控制HBV感染中所存在的低无应答、低效激起细胞免疫、无法打破免疫耐受以及氢氧化铝佐剂副反应等问题。[方法]：第一部分是以HBV核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒为骨架,将HBV优势表位(HBsAg“α”抗原决定簇aa119-152片段；HBsAg"a”抗原决定簇aa139-148片段；preS1aa21-47片段；preS1aa37-45片段)插入到全长(aa1-183)或截短(aa1-144)HBc的主要免疫显性区域(Major Immunodominant Region, MIR)或者羧基端(aa144以后),构建系列表面展示HBV优势表位的HBc嵌合病毒样颗粒,并利用小鼠实验评价其免疫原性。其中所涉及的实验技术主要有基因优化技术、重组以及普通PCR技术、基因克隆技术、原核表达技术、蛋白纯化技术、蛋白鉴定技术、ELISPOT技术、流式细胞术等。第二部分是借鉴多糖偶联流感嗜血杆菌D蛋白疫苗构建的成功经验,从流感嗜血杆菌全基因组中通过巢式PCR技术获取D蛋白非酰化区域(命名为H17),并将其酶切连接入pET43.1a表达载体中,在E.coli表达工程菌中进行表达。然后利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析技术对目的蛋白进行纯化,进而获取纯度好、浓度高的H17蛋白。并利用戊二醛交联技术-分子筛分离偶联单体二步法将其与乙肝疫苗主成分HBsAg进行共价偶联,制备实验用偶联疫苗制剂,最后利用小鼠动物模型对此实验用偶联疫苗制剂的免疫原性进行评价。[结果]：第一部分成功构建H2、H3、H8、H9、H10、H11、S47、H20、H21等九个插入HBV优势表位的HBc为骨架蛋白的表达质粒(H20、H21分别为全长和截短HBc空载体),并利用原核表达系统进行表达。通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、蛋白浓缩技术、蛋白透析复性技术、分子筛层析技术、超速离心技术获取H2、 H3、H8、H9、H11、S47等六个表面展示HBV优势表位的HBc-VLPs。最后选取H8、H11作为新制剂方案,并利用动物实验对其进行疫苗效果评价。H8可以诱发小鼠产生针对HBsAgpreS1的抗体,但针对HBsAg抗体水平相对preS1偏低(p<0.05),抗体水平都在42-49天达到峰值；ELISPOT吉果表明H8刺激免疫小鼠脾细胞实验中,IFN-y分泌细胞增生明显,显示可以有效激活Th1类细胞免疫应答；流式细胞术结果表明CD4+T细胞和CD8+T细胞在脾细胞中比例相对对照组明显增加(p<0.05),而且CD4+T细胞/CD8+T细胞比例相对对照组明显下降(p<0.05),提示H8可以诱发机体特异性CD8+T细胞的分化。H11可以诱发小鼠产生针对HBsAg的抗体,抗体水平在49-56天达到峰值；ELISPOT结果表明H11刺激免疫小鼠脾细胞实验中,IFN-y分泌细胞增生明显(p<0.05),显示可以有效激活Thl类细胞免疫应答；流式细胞术结果表明CD4+T细胞和CD8+T细胞在脾细胞中比例相对对照组明显增加(p<0.05),而且CD4+T细胞/CD8+T细胞比例相对对照组明显下降(p<0.05),提示H11可以诱发机体特异性CD8+T细胞的分化。第二部分利用巢式PCR技术获取流感嗜血杆菌D蛋白非酰化区域基因片段(命名为H17),并通过原核表达获取可溶性H17蛋白。利用硫酸铵分级沉淀、蛋白透析复性技术、离子交换层析等纯化技术获取高纯度、高浓度的H17蛋白,并通过Western Blotting检测其抗原性。利用戊二醛交联技术分子筛分离单体两步法共价偶联H17和HBsAg,并利用异种抗体夹心法初步评价偶联疫苗制剂抗原效价(1：1600)。动物实验证实,偶联疫苗制剂可以诱发小鼠产生针对HBsAg的高水平抗体,抗体水平在35-42天达到峰值,并在跟踪期间连续15周持高,比HBsAg单独免疫组和PBS组抗体水平都高(p<0.05),但比乙肝疫苗组低(p<0.05)。首针免疫偶联疫苗制剂组抗体水平升高明显(p<0.05),显示其免疫原性最强；ELISPOT实验结果表明,在刺激IL-4分泌细胞增生上,偶联疫苗制剂和乙肝疫苗水平相当(p>0.05),都比HBsAgfPPBS组高(p<0.05),显示在激发Th2类细胞免疫应答上,偶联疫苗制剂与乙肝疫苗水平相当,都比其他实验对照组强烈。但在刺激IFN-γ分泌细胞增生水平上,偶联疫苗制剂相比于其他实验及对照组都高(P<0.05),显示在激发Th1类细胞免疫应答水平上,偶联疫苗比其他实验对照组有优势；流式细胞术结果表明，相对于PBS组，CD4+T细胞和CD8+T细胞在脾细胞中比例明显升高，而且CD4+T细胞/CD8+T细胞比例相对对照组明显下降同，提示偶联疫苗制剂可以诱发机体特异性CD8+T细胞的分化。[结论]：第一部分,表面展示HBV优势表位的嵌合HBc病毒样颗粒H8和H11有效地将HBc和HBV优势表位(HBsAg "a"抗原决定簇或者preS1中和表位)串联到一个蛋白单体上(这对全面激发机体产生针对HBV的免疫应答至关重要),单体通过相互作用最终组装成病毒样颗粒。此病毒样颗粒在动物实验中有效激发小鼠产生了高水平的针对HBV优势表位的抗体,并有效激起Thl类细胞免疫应答,CD8+T细胞比例和数量都有所增加,充分显示其疫苗潜能。第二部分,偶联疫苗制剂将具强T细胞表位、疫苗载体潜能的流感嗜血杆菌杆菌D蛋白共价偶联到乙肝疫苗主成分HBsAg上,转变HBsAg的抗原递呈途径,使其有可能打破免疫耐受,消除低无应答等问题。动物实验也证实,偶联疫苗制剂充分激发小鼠产生了高水平的针对HBsAg的抗体,虽然峰值抗体水平低于乙肝疫苗,但在诱发Thl类细胞应答方面更强(Th2类细胞应答方面相当),CD8+T细胞比例和数量都有所增加,充分显示其疫苗潜能。