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西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.)Matsum&Nadai]属葫芦科，西瓜属，作为高产的经济作物之一，被世界各地广泛种植。但在生产中易受到各种病虫害的危害，特别是枯萎病(Fusarium wilt)，对西瓜的产量和品质有极其严重的影响。选育出抗枯萎病品种是最快速有效的解决途径之一。因此探明西瓜抗枯萎病机理，并找到相应的抗枯萎病基因是至关重要的。
效应蛋白是一类小分子病原体蛋白，其作用是改变寄主细胞结构和功能。它一般通过与寄主中的抗病蛋白互作启动下游免疫调控。研究发现效应蛋白FonSIX6是西瓜尖孢镰刀菌的无毒因子，是影响致病性的关键因子。生物信息学分析表明，FonSIX6蛋白具有RNA结合的基序，推测它很可能与寄主中的RNA互作。大量研究已证实植物中的非编码RNA参与抗病调控并发挥重要作用。但是关于FonSIX6与寄主非编码RNA的互作在抗病反应中的调控机制还未有相关报道。关于蛋白和RNA互作的研究技术还不多，而且大多都不成熟，其中，GoldCLIP技术(Gel - omitted and ligation - dependent CLIP)，它可以高效且快速的筛选出与蛋白互作的RNA，但该技术目前仅在动物中有报道，本研究拟对该技术进行改良，对与FonSIX6蛋白互作的西瓜和烟草的非编码RNA进行筛选。希望能建立一个比较成熟的GoldCLIP体系，为今后植物蛋白-RNA互作研究提供技术支持，也希望筛选到与FonSIX6互作的非编码RNA，为其在西瓜中介导的抗病机制有一个初步的认识。本研究主要结果如下：
(1)构建P35S:HaloTag-FonSIX6-PBI121载体，并利用农杆菌介导法遗传转化将其转化到西瓜‘JJZ’和烟草‘本氏’品种中，利用PCR检测最终分别筛选出2个西瓜和12个烟草P35S:HaloTag-FonSIX6-PBI121T0代转基因阳性植株。
(2)将阳性P35S:HaloTag-FonSIX6-PBI121西瓜转基因叶片进行紫外交联，通过GoldCLIP技术共获得84个克隆，对其进行多序列比对，去掉接头和重复序列后，共得到4条特异的RNA序列，在(CuGenDB, http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/tool/blast.cgi)网站上分别对这4条序列进行blast比对，结果发现它们不能定位到现有的西瓜基因组数据库，但部分RNA序列可以在甜瓜(DHL92)mRNAv4.0库中定位在两个基因上(MELO3c027805.2.1和MELO3c031322.2.1)，推测可能的原因是现有西瓜基因数据库中所用材料与本实验所用的西瓜材料不同，可能导致获得的RNA序列不能被定位。
(3)将阳性P35:HaloTag-FonSIX6-PBI121转基因烟草叶片进行紫外交联，通过GoldCLIP技术共筛到75个克隆，对其进行多序列比对，去掉接头和重复序列后共得到7条特异的RNA序列，在网站(https://solgenomics.net/)上的分别对这7条序列进行blast比对，发现可以在N.tabacumGenomes(Current version)基因库中定位在11个基因上，分别是Nitab4.5-0660344，0359768，0309180，0251996，0376295，0350689，1074600，0110193，0052963，0233874，0747497。
通过GoldCLIP技术，获得以上的数据结果，说明该技术体系初步建立。该技术相比其他传统方法，成功的将Halotag标签与FonSIX6蛋白融合后简化在体外纯化蛋白质和核酸复合物的操作步骤，与磁珠形成共价固定在一起后，不管用任何的洗涤剂还是变性的条件下都不会将互作的RNA洗掉，可以对复合物进行纯化，大大的提高了效率，减少了同位素标记以及跑胶转膜等一些繁琐步骤。为今后筛选植物蛋白和RNA互作研究提供新技术。
效应蛋白是一类小分子病原体蛋白，其作用是改变寄主细胞结构和功能。它一般通过与寄主中的抗病蛋白互作启动下游免疫调控。研究发现效应蛋白FonSIX6是西瓜尖孢镰刀菌的无毒因子，是影响致病性的关键因子。生物信息学分析表明，FonSIX6蛋白具有RNA结合的基序，推测它很可能与寄主中的RNA互作。大量研究已证实植物中的非编码RNA参与抗病调控并发挥重要作用。但是关于FonSIX6与寄主非编码RNA的互作在抗病反应中的调控机制还未有相关报道。关于蛋白和RNA互作的研究技术还不多，而且大多都不成熟，其中，GoldCLIP技术(Gel - omitted and ligation - dependent CLIP)，它可以高效且快速的筛选出与蛋白互作的RNA，但该技术目前仅在动物中有报道，本研究拟对该技术进行改良，对与FonSIX6蛋白互作的西瓜和烟草的非编码RNA进行筛选。希望能建立一个比较成熟的GoldCLIP体系，为今后植物蛋白-RNA互作研究提供技术支持，也希望筛选到与FonSIX6互作的非编码RNA，为其在西瓜中介导的抗病机制有一个初步的认识。本研究主要结果如下：
(1)构建P35S:HaloTag-FonSIX6-PBI121载体，并利用农杆菌介导法遗传转化将其转化到西瓜‘JJZ’和烟草‘本氏’品种中，利用PCR检测最终分别筛选出2个西瓜和12个烟草P35S:HaloTag-FonSIX6-PBI121T0代转基因阳性植株。
(2)将阳性P35S:HaloTag-FonSIX6-PBI121西瓜转基因叶片进行紫外交联，通过GoldCLIP技术共获得84个克隆，对其进行多序列比对，去掉接头和重复序列后，共得到4条特异的RNA序列，在(CuGenDB, http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/tool/blast.cgi)网站上分别对这4条序列进行blast比对，结果发现它们不能定位到现有的西瓜基因组数据库，但部分RNA序列可以在甜瓜(DHL92)mRNAv4.0库中定位在两个基因上(MELO3c027805.2.1和MELO3c031322.2.1)，推测可能的原因是现有西瓜基因数据库中所用材料与本实验所用的西瓜材料不同，可能导致获得的RNA序列不能被定位。
(3)将阳性P35:HaloTag-FonSIX6-PBI121转基因烟草叶片进行紫外交联，通过GoldCLIP技术共筛到75个克隆，对其进行多序列比对，去掉接头和重复序列后共得到7条特异的RNA序列，在网站(https://solgenomics.net/)上的分别对这7条序列进行blast比对，发现可以在N.tabacumGenomes(Current version)基因库中定位在11个基因上，分别是Nitab4.5-0660344，0359768，0309180，0251996，0376295，0350689，1074600，0110193，0052963，0233874，0747497。
通过GoldCLIP技术，获得以上的数据结果，说明该技术体系初步建立。该技术相比其他传统方法，成功的将Halotag标签与FonSIX6蛋白融合后简化在体外纯化蛋白质和核酸复合物的操作步骤，与磁珠形成共价固定在一起后，不管用任何的洗涤剂还是变性的条件下都不会将互作的RNA洗掉，可以对复合物进行纯化，大大的提高了效率，减少了同位素标记以及跑胶转膜等一些繁琐步骤。为今后筛选植物蛋白和RNA互作研究提供新技术。