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对急性白血病的治疗已取得很大进展，国内外对儿童急性白血病化学治疗进行了较多的临床探索，化疗方案几经改进，但仍不尽人意。寻找高效低毒的选择性抗癌药物是白血病治疗的必然趋势。
在基因治疗领域，RNA干扰(RNAinterference，RNAi)为病毒感染、肿瘤以及其它很多疾病的治疗提供了新的治疗思路，应用前景极为广阔。到目前为止较为常用的制备siRNA的方法有以下5种：(1)化学合成法(2)体外转录法(3)核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)Ⅲ家族体外消化法(4)siRNA表达载体法(5)siRNA表达框架法。后两种方法是体内表达，基于具有合适启动子的载体或转导元件在哺乳动物或细胞中转录生成siRNA。其中siRNA表达载体法通过转染含有RNaseⅢ启动子U6或H1及其下游一小段特殊结构的质粒或病毒到宿主细胞内，转录出短发夹状RNA(shorthairpinRNA，shRNA)，shRNA在胞内被Dicer酶剪切成siRNA而发挥作用。优点是转录筛选后可稳定表达，允许包括胚胎干细胞在内的大范围细胞系RNAi的持续作用；解决转染效率低的问题，无Rnase污染。缺点是不适于筛选有效siRNA序列。RNAi用于肿瘤基因治疗存在下列问题：(1)siRNA的转染方法和效率：目前基因治疗最大的限制因素就是核酸转运效率低下，在开始临床实验之前，需找到更合适的将siRNA转染动物体内细胞的方法。(2)有效地把siRNA导入到体内靶组织，维持其活性，是验证siRNA有效性及将来成功用于治疗的关键。生物载体中病毒载体导入在某些动物模型上已被证实有效且持续时间长，其中基于人类免疫缺陷Ⅰ型病毒(humanimmunodeficiencyvirusⅠ，HIV-Ⅰ)的慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，成为目前较有前途的病毒载体，且适于骨髓。
近年来的研究成果证实了肿瘤生长依赖于血管生成，并发现血管生成也是肿瘤转移所必需的，且至少部份地导致肿瘤多药耐药。研究结果表明，多种血液系统肿瘤存在明显的骨髓血管新生现象。肿瘤细胞分泌的多种血管生成因子之间相互联系和调控，其中血管内皮细胞生成因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和血管内皮细胞生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，VEGFR)处于整个肿瘤血管生成过程的上游和中心。VEGFR2在VEGF的信号转导及血管内皮生成、迁移、抑凋亡中起主导作用。以VEGF及其受体作为相对特异性肿瘤血管生成标志物，抑制其表达或阻断其效应是目前国外抗血管生成治疗肿瘤的热点，将为肿瘤的临床治疗探索一条新途径。
近年，VEGF及VEGFR2与白血病的关系日益受到重视。首先VEGF以旁分泌的方式调节白血病的血管形成，即白血病细胞分泌的VEGF选择性作用于血管内皮细胞(endothelialcell，EC)上的特异性VEGFR2，并通过酪氨酸激酶介导的信号转导，不仅促进产生新生血管，导致骨髓异常增殖，还对维持肿瘤新生血管的生存起着重要作用。目前，越来越多的证据表明，白血病中存在VEGF/VEGFR2的自分泌机制，即白血病细胞分泌的VEGF诱导自身表达VEGFR2，从而维持自身存活、增殖，阻止肿瘤细胞凋亡，增强血液肿瘤细胞对放化疗的抵抗作用，并引起细胞迁移。目前针对VEGF及其受体进行抑制肿瘤的治疗方法中有三方面受到重视：①抑制VEGF的小分子化合物；②针对受体的药物设计；③酪氨酸激酶抑制剂。现已有VEGFR2单克隆抗体(monoclonalantibody，McAb)应用于临床实验，但其靶点需经过细胞表面呈递来决定是否特异结合；而白血病病人免疫抑制，McAb作用完全性有可疑。反义寡核苷酸技术没有放大效应，用量较大，抑制基因表达效果为50％-90％，对一些受体核特殊蛋白的抑制作用仅10％-20％。而RNAi技术能快速、高效、特异地抑制靶基因表达，在哺乳动物细胞中一般使用浓度极低。由于RNAi有明显放大作用，抑制靶向蛋白表达效果更加明显，在疾病的基因治疗上有广阔的应用前景。
基于上述研究，本研究拟利用先进的shRNARNAi技术，首先筛选出有效人VEGFR2siRNA，设计合成shRNA，将插入shRNA的表达载体与慢病毒包装质粒整合，体外作用于人EC株和表达VEGFR2的白血病细胞株HL60，观察沉默效果；在此基础上将shRNA用慢病毒载体导入NOD/SCID小鼠作全身白血病型抑瘤研究，探讨VEGFR2shRNA是否阻断白血病细胞的旁分泌途径，抑制新生血管形成及是否作用于白血病细胞，影响VEGF自分泌途径，促进白血病细胞凋亡。
第一章.VEGFR2siRNA的设计与筛选
RNAi现象能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，对RNAi的不断深入了解以及相应试剂盒的问世，为利用RNAi技术进行各项研究奠定了基础，将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具，并可用于抗肿瘤等的基因治疗。VEGFR2及其信号转导中的关键蛋白质是抗白血病及抗血管生成疗法的适宜靶点，可增加治疗的特异性，提高疗效，减少毒副作用。本实验拟设计3对VEGFR2siRNA，化学合成后筛选出抑制HL60细胞VEGFR2表达效果最强的一对，并用于后续实验。
第二章.shRNA入门克隆对HL60及EC细胞VEGFR2的瞬时抑制
本研究拟根据筛选出的有效siRNA设计VEGFR2shRNA，利用siRNA表达载体法，构建入门克隆pU6/shVEGFR2，瞬时转染人EC和HL60细胞，观察其对VEGFR2表达的干扰效果。
第三章.携带shRNA的慢病毒载体转导HL60细胞
用shRNA表达质粒实施基因沉默的优势在于可以使质粒序列整合到靶细胞的基因组上，实现shRNA的稳定表达和对基因的持续抑制。所用载体影响到shRNA的转导效率。本章的目的是应用是以HIV-1为基础发展起来的慢病毒载体将针对VEGFR2的shRNA表达质粒转导HL60细胞，验证是否能高水平抑制其VEGFR2的表达。
第四章.慢病毒介导的shRNA对HL60模型鼠VEGF/VEGFR2旁分泌和自分泌的影响
本实验前面的研究已建立以慢病毒为载体的Lenti6/shVEGFR2，可在体外抑制白血病细胞HL60和ECVEGFR2的表达。故本节试图从直接杀死白血病细胞和抑制血管生成两个方面研究动物体内白血病治疗的新策略，在临床治疗中可能具有更大的意义。
结论
1.综合现有设计siRNA原则，所设计的siRNA经化学合成后抑制HL60细胞VEGFR2表达效果较强。
2.首次构建入门克隆pU6/shVEGFR2。瞬时转染HL60和人脐静脉内皮细胞株EA·hy926细胞，可抑制VEGFR2表达及HL60细胞生长。
3.pU6/shVEGFR2入门克隆转染HL60细胞后对细胞的抑制优于siRNA。
4.使用含GateWayTM技术的pLenti6/V5-DESTTM载体，通过重组在入门和表达载体间可快速转换shVEGFR2，首次构建慢病毒携带的Lenti6/shVEGFR2表达克隆。
5.相比pU6/shVEGFR2入门克隆转染，pLenti6/shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后持续高水平抑制细胞。
6.肿瘤细胞HL60对EC有骨髓趋化性，有助于白血病模型鼠的建立。
7.重组慢病毒Lenti6/shVEGFR2具有抑制白血病小鼠骨髓血管生成的作用；VEGFR2siRNA可阻断白血病HL60细胞VEGF/VEGFR2自分泌的内环路，在体外、动物体内均得到验证；VEGF/VEGFR2自分泌链和旁分泌链的联合阻断加强了抗白血病效果。VEGFR2RNAi可望作为白血病基因治疗的新策略。