目的:随着终末期肝病和肝源性肿瘤发病率和死亡率逐年升高,肝移植手术显得尤为迫切,而肝脏缺血再灌注损伤是临床上肝移植的主要制约因素之一,极大降低了肝移植的成功率,目前尚无确切有效的防治措施。因此,探索肝脏缺血再灌注损伤的内在机制和探求有效的治疗策略具有重要意义。E1A激活基因阻遏子(CREG)作为一个具有转录调控作用的基因,可以有效抑制心肌肥大、心肌纤维化、动脉粥样硬化等疾病的发生发展进程,并在肿瘤发生发展过程中也具有重要意义,然而其在肝脏中仅有文献报道对糖脂代谢的调控作用,CREG与肝脏缺血再灌注过程的关系尚未见报道。本课题旨在探讨CREG对肝脏缺血再灌注的作用以及具体机制。方法:1.检测CREG在肝脏缺血再灌注中的表达。1.1收集正常肝脏捐献者和肝移植术后病人的肝脏组织标本,用westernblot检测CREG的蛋白水平。1.2建立体内模型,在野生型小鼠(WT)体内建立肝脏缺血再灌注模型,用western-blot和real-time PCR分别检测了CREG的蛋白和m RNA表达水平。1.3建立体外模型,在原代肝细胞中建立细胞缺氧复氧模型,用westernblot检测CREG的蛋白水平。2.检测肝脏特异性CREG基因敲除小鼠(CREG-HKO)对肝脏缺血再灌注的影响。2.1检测CREG-HKO小鼠经过缺血再灌注处理对肝脏损伤的影响。用western-blot验证CREG-HKO小鼠情况;用H&E染色评估CREG-HKO小鼠在模型下的坏死面积和程度;用ELISA试剂盒检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量,评估小鼠肝脏的损伤情况。2.2检测CREG-HKO小鼠经过缺血再灌注处理后对肝细胞死亡和增殖的影响。用免疫荧光染色TUNEL试剂盒、real-time PCR、western-blot和LDH试剂盒检测各组(WT小鼠和CREG-HKO小鼠在假手术和缺血再灌注手术处理后)肝脏的凋亡情况;用免疫荧光染色PCNA试剂盒、realtime PCR和MTT试剂盒检测各组肝脏的增殖情况。2.3检测CREG-HKO小鼠经过缺血再灌注处理后对肝细胞炎症的影响。用免疫荧光染色、ELISA试剂盒、real-time PCR、western-blot检测各组(WT小鼠和CREG-HKO小鼠在假手术和缺血再灌注手术处理后)肝脏的炎症情况。3.筛选了肝脏特异性CREG基因敲除对MAPK信号通路的影响。3.1在WT小鼠、CREG-HKO小鼠上给予假手术、缺血再灌注手术处理,用western-blot检测各组MAPK信号通路关键蛋白的激活情况。3.2提取WT小鼠、CREG-HKO小鼠的原代肝细胞,给予常氧和缺氧复氧处理,用western-blot检测各组MAPK信号通路关键蛋白的激活情况。4.检测TAK1对CREG参与调节肝脏缺血再灌注的作用4.1检测TAK1抑制剂5Z-7-ox对于CREG参与调节肝脏缺血再灌注的影响。用ELISA试剂盒、real-time PCR、western-blot检测各组(WT和CREG-HKO小鼠在缺血再灌注状态下,分别给予溶剂DMSO和抑制剂5Z-7-ox预处理)血清的转氨酶和炎症因子、肝脏组织的凋亡、增殖、炎症相关因子的表达。4.2用免疫共沉淀检测CREG和TAK1的相互作用,并且深入探索相互作用的位点和区域。4.3分别用GFP、野生型CREG和突变后的CREG腺病毒感染肝细胞,用western-blot、real-time PCR、ELISA试剂盒、MTT试剂盒、LDH试剂盒检测各组的炎症、细胞凋亡和增殖状态。结果:1.人体肝移植标本与正常人相比,肝脏组织中的CREG蛋白水平显著下调;行缺血再灌注损伤手术小鼠与正常小鼠相比,肝脏组织CREG的m RNA和蛋白水平显著下调;体外经过缺氧复氧的肝细胞与正常处理的肝细胞相比,CREG的蛋白表达显著下调。2.CREG-HKO小鼠,与正常WT小鼠相比,经过肝脏缺血再灌注损伤后,肝脏损伤明显加重;CREG-HKO小鼠,与正常WT小鼠相比,经过肝脏缺血再灌注损伤后,细胞死亡明显增强,细胞增殖明显减弱;CREGHKO小鼠,与正常WT小鼠相比,经过肝脏缺血再灌注损伤后,小鼠炎症反应明显加强。3.在缺血再灌注损伤过程中,CREG基因敲除小鼠与WT小鼠相比,肝脏组织中MAPK通路处于明显激活状态;CREG可以直接与TAK1相互作用;CREG主要与TAK1中包含TAB1结合位点和激酶结构域的N端相互作用,从而抑制TAK1磷酸化;TAK1抑制剂腹腔注射到CREGHKO小鼠后,缺血再灌注导致的肝脏损伤减轻。结论:本研究的实验结果表明,CREG是肝脏缺血再灌注的负调控因子,且其抑制作用主要依赖于与TAK1结合并抑制其磷酸化。因此,CREG和CREG-TAK1有望成为临床上治疗缺血再灌注损伤的重要靶点。