论文部分内容阅读
RNA编辑是改变RNA分子序列的一种转录后修饰现象，包括碱基的插入、缺失或核苷酸的替换。目前发现从病毒到高等真核生物都广泛存在RNA编辑现象。PPR（pentatricopeptide repeats）蛋白是植物中具有RNA编辑功能的一类重要的蛋白质，大多数关于PPR蛋白的功能机制研究结果来源于反向遗传学的实验结论。因此，对于PPR蛋白结构与功能关系的研究是破解植物RNA编辑机制的关键。
OTP82蛋白是拟南芥PPR蛋白家族中PLS亚类中的重要成员，为核编码蛋白质，经转运后在叶绿体中对底物RNA进行编辑，是研究PPR蛋白家族的良好模型。OTP82 N端为PPR结构域（PPR domain），具有RNA识别及结合能力；而其C端具有E结构域（E domain）、E+结构域（E+domain）及DYW结构域（DYW domain），主要完成底物RNA的编辑。在已有报道中单独的C端DYW结构域并不能完成底物RNA编辑，因此，OTP82 C端结构中其它结构域在RNA编辑中的作用机制以及C端各结构域的相互关系对于揭示OTP82蛋白的编辑功能有着重要的意义。
本论文以 OTP82 C 端结构为研究对象，通过基因工程方法制备包含不同C端结构域的OTP82 C端突变体，并通过结合实验分析不同突变体与底物RNA的结合功能，推测C端各结构域在RNA编辑中的作用。同时，由于OTP82蛋白具有锌指结构，因此，论文对Zn2+在含锌指结构蛋白的原核表达中的作用机制也进行了探讨。论文总体可分为两个部分：
第一部分利用大肠杆菌SUMO表达系统对RNA编辑PPR蛋白OTP82的全长及C端突变体进行原核表达，并完成C段突变体底物结合的功能检测。成功完成3种OTP82 C端突变体的原核表达，包括突变体EE+D（包含E、E+、DYW结构域）、E+D（包含E+、DYW结构域），以及DYW结构域的融合蛋白HSD。不同突变体的体外结合实验结果表明DYW结构域对OTP82蛋白C端与底物RNA的结合具有重要作用，而C端的E、E+结构域对于DYW结构域的稳定起到了重要作用。并且提高了DYW结构域与RNA的结合能力。同时， DYW结构域对底物RNA的构象具有选择性。
本文的第二部分对Zn2+与OTP82蛋白的锌指结构片段的作用机制进行了初步探索，证明了Zn2+与锌指结构序列的相互作用具有特异性，并且Zn2+作用于蛋白的表达过程中，可以明显提高融合蛋白的表达量并提高锌指蛋白的稳定性。
OTP82蛋白是拟南芥PPR蛋白家族中PLS亚类中的重要成员，为核编码蛋白质，经转运后在叶绿体中对底物RNA进行编辑，是研究PPR蛋白家族的良好模型。OTP82 N端为PPR结构域（PPR domain），具有RNA识别及结合能力；而其C端具有E结构域（E domain）、E+结构域（E+domain）及DYW结构域（DYW domain），主要完成底物RNA的编辑。在已有报道中单独的C端DYW结构域并不能完成底物RNA编辑，因此，OTP82 C端结构中其它结构域在RNA编辑中的作用机制以及C端各结构域的相互关系对于揭示OTP82蛋白的编辑功能有着重要的意义。
本论文以 OTP82 C 端结构为研究对象，通过基因工程方法制备包含不同C端结构域的OTP82 C端突变体，并通过结合实验分析不同突变体与底物RNA的结合功能，推测C端各结构域在RNA编辑中的作用。同时，由于OTP82蛋白具有锌指结构，因此，论文对Zn2+在含锌指结构蛋白的原核表达中的作用机制也进行了探讨。论文总体可分为两个部分：
第一部分利用大肠杆菌SUMO表达系统对RNA编辑PPR蛋白OTP82的全长及C端突变体进行原核表达，并完成C段突变体底物结合的功能检测。成功完成3种OTP82 C端突变体的原核表达，包括突变体EE+D（包含E、E+、DYW结构域）、E+D（包含E+、DYW结构域），以及DYW结构域的融合蛋白HSD。不同突变体的体外结合实验结果表明DYW结构域对OTP82蛋白C端与底物RNA的结合具有重要作用，而C端的E、E+结构域对于DYW结构域的稳定起到了重要作用。并且提高了DYW结构域与RNA的结合能力。同时， DYW结构域对底物RNA的构象具有选择性。
本文的第二部分对Zn2+与OTP82蛋白的锌指结构片段的作用机制进行了初步探索，证明了Zn2+与锌指结构序列的相互作用具有特异性，并且Zn2+作用于蛋白的表达过程中，可以明显提高融合蛋白的表达量并提高锌指蛋白的稳定性。