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金银花(Chinese honeysuckle,Flos Lonicerae)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾,为常用中药,具有清热解毒、抗病毒等功能,是一种“药食同源”的绿色天然产物,被广泛应用于各种临床疾病的治疗,已具有几千年的历史。忍冬枝叶和金银花中主要成分为有机酸类、黄酮类、挥发油、三萜苷类、环烯醚萜苷类、神经酰胺类化合物等。2005年新版中华人民共和国国药典将忍冬(Lonicera japonica Thunb.)作为金银花药材的惟一来源,规定绿原酸和木犀草苷作为金银花的质量控制指标。该药材中的绿原酸和木犀草苷具有显著的生理活性。其中绿原酸是抗菌解毒、消炎利胆的主要活性物质,而木犀草素及其苷具有抗诱变、抗肿瘤、抗感染、抗过敏等药理活性,近年发现绿原酸类物质有抗癌、抗艾滋病的作用,可作为先导设计开发抗癌药物。同时,作为良好的抗氧化剂,绿原酸不仅应用于医药行业上,在日用化工、食品等领域都有广泛的应用。因此,研究绿原酸和木犀草苷的生产工艺对于综合利用忍冬等植物资源具有重要意义。目前,有关金银花中绿原酸的提取工艺已有大量相关文献报道,但尚未有木犀草苷提取工艺研究和同时提取绿原酸和木犀草苷工艺研究报道。本文以汉中金银花基地所产金银花为试材,利用纸层析—分光光度法、HPLC、薄层层析法、柱色谱分离法、质谱,红外光谱法等分析方法和检测技术,以绿原酸和木犀草苷为检测指标,采用单因素实验、正交设计和优化实验等对金银花中绿原酸和木犀草苷的提取、分离和纯化工艺进行了探讨,建立优化的工艺参数,为综合利用大规模化生产绿原酸和木犀草苷提供理论依据和生产技术支持。获得以下主要结果:1、金银花中绿原酸和木犀草苷同时提取工艺研究以金银花中绿原酸和木犀草苷得率为考察指标,分别通过提取方法的筛选、单因素实验、正交试验和优化实验对金银花中绿原酸和木犀草苷同时提取工艺参数进行探讨。(1)以25%,40%,55%,70%,85%等不同浓度乙醇为提取溶剂,分别采用超声提取法和加热浸提法(醇提法)对绿原酸和木犀草苷进行提取,比较筛选。结果显示,醇提法绿原酸和木犀草苷平均得率分别比超声波法的相对高出25%和43.7%,表明醇提法优于超声促提法。因此后续实验都采用加热浸提法。(2)以金银花提取液中绿原酸和木犀草苷含量为考察指标,通过乙醇浓度、pH值、料液比、浸提时间和温度等单因素提取实验,获得提取最佳条件为:55%乙醇作为提取溶剂,pH值6.0,料液比1:14,提取时间为2小时,提取温度60℃。(3)通过正交实验和优化筛选实验,最终确定了绿原酸和木犀草苷同时提取最佳工艺参数。其中,提取剂为70%乙醇,pH值6.0,料液比1:14,提取时间为2小时,提取温度60℃,绿原酸和木犀草苷得率分别为5.61%、0.258%。2、大孔树脂同时分离纯化金银花中绿原酸和木犀草苷工艺研究(1)通过静态吸附和解吸试验,以绿原酸、木犀草苷饱和吸附量和解吸率为考察指标,对非极性D101、中等极性LSA-40和强极性LSD001等3类树脂进行筛选。结果表明,二者与强极性LSD001树脂吸附效果最好,但解吸效果最差;非极性D101树脂对绿原酸和木犀草均具有较好的吸附和解吸能力,因此非极性D101树脂为分离的最佳选择。(2)以绿原酸和木犀草苷吸附量为考察指标,通过上样液浓度,上样液pH值和上样速度等单因素实验进行动态吸附,获得各单因素实验动态吸附工艺参数。其中,上样液浓度为1:8,pH=4,流速确定为3 BV/h。(3)以绿原酸和木犀草苷吸附量为考察指标,在单因素实验的基础上,设计3因素3水平正交试验进行动态吸附,探讨上样吸附工艺最佳参数。综合考察绿原酸和木犀草苷的吸附量,最终确定最佳上样因素组合条件为A1B2C2,即上样浓度1:10,上样液pH=4,上样流速为3 BV/h。(4)以绿原酸和木犀草苷解吸率为考察指标,动态洗脱实验结果表明,绿原酸集中在水和10%、20%醇溶液洗脱部分,解吸率达93.3%;从木犀草苷解吸率来看,木犀草苷集中在30%和40%醇溶液洗脱部分,解吸率达93.1%。结合洗脱剂用量BV和有效成分分离效果,表明绿原酸相继用水和10%、20%醇溶液进行洗脱,洗脱剂用量分别为5 BV、6 BV和6 BV;木犀草苷相继用30%和40%醇溶液进行洗脱,洗脱剂用量分别为8 BV和9 BV。同时可以得知,木犀草苷较绿原酸难洗脱。综合结论认为,同时分离纯化绿原酸和木犀草苷最佳工艺条件:大孔树脂选用D101树脂;最佳上样条件—上样浓度为1:10,上样液pH=4,上样流速为3 BV/h;水和10%、20%醇溶液洗脱绿原酸,30%和40%醇溶液洗脱木犀草苷。3、绿原酸和木犀草苷标准品制备方法研究采用薄层检测、理化性质检测、波谱鉴定和HPLC法纯度检测等方法和技术,对绿原酸和木犀草苷标准品的纯化制备进行了研究。结果表明:(1)D101大孔树脂富集绿原酸的浸膏经一次硅胶柱层析后,绿原酸含量增加至80.23%,经重结晶升至98.11%,回收率93.01%。此方法操作简单,成本低(硅胶价格经济实惠),得到的绿原酸纯度高,为绿原酸的大量制备提供高效、可靠的制备方法。(2)经D101大孔树脂富集木犀草苷的浸膏经一次聚酰胺柱层析,重结晶后得木犀草苷纯品,纯度高于98%,回收率为92.14%。该法操作简便,节省时间,同时也克服了黄酮在硅胶上拖尾严重,不易被分离纯化的缺点,且聚酰胺可以回收重复利用,因此该法给规模化生产制备木犀草苷提出了一个新思路。本论文首次同时以绿原酸和木犀草苷检测指标,对金银花中绿原酸和木犀草苷的提取、分离和纯化工艺进行了系统研究,建立了操作简单,生产成本低,得率高的制备技术路线,确定了绿原酸、木犀草苷同时提取工艺参数,同时分离纯化工艺参数,以及标准品的制备方法。该研究结果为综合利用忍冬等植物资源,规模化生产绿原酸和木犀草苷提供了重要的理论依据和生产技术支持。