脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是目前世界范围内常见的且破坏性极强的神经系统疾病,导致相应节段出现感觉、运动功能障碍、肌力、反射等改变。其主要包括原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤是突然发生的,造成神经元和脉管系统的破坏,是临床上无法治疗的不可逆转性损伤;继发性损伤是原发性脊髓损伤后数小时出现的,其病理改变部分可以逆转,其损伤机制与脊髓组织水肿、出血、炎性细胞浸润、微循环障碍、细胞凋亡等机制相互作用有关。目前临床上脊髓损伤主要通过手术减压固定、营养神经类药物及激素、干细胞移植及高压氧等治疗方式,来保护损伤部位脊髓组织,促进神经功能的恢复。但这些治疗方法均未取得满意效果。曲克芦丁是天然生物类黄酮芦丁的半合成衍生物,药理作用广泛,如抗氧化、抗炎、抑制红细胞血小板聚集、改善微循环、促进新生血管生成和保护神经等作用。目前主要用于水肿、痔疮、糖尿病并发症、静脉血栓、心脑血管等疾病的治疗,然而它在脊髓损伤的潜在治疗功效从未被发现。为探索曲克芦丁对脊髓组织的影响,本研究用曲克芦丁治疗SCI大鼠模型,对脊髓组织全基因组的差异基因表达进行了生物信息学分析,发现曲克芦丁组差异基因m RNA水平的表达显著升高。最后用Western Blot来验证差异基因的表达,结果显示蛋白表达结果与测序结果一致;该研究发现为临床曲克芦丁治疗脊髓损伤提供了一定的科学依据。一:曲克芦丁对脊髓运动功能及形态学功能的影响目的研究曲克芦丁是否对脊髓损伤大鼠后肢运动功能及神经有恢复的功效,分析曲克芦丁作用于脊髓损伤大鼠后,在用药的不同时间段,与正常大鼠及对照组大鼠后肢运动功能的差异、以及脊髓损伤局部形态学功能的观察。方法1.建立SD大鼠脊髓损伤模型;Sham组:只做椎板切除,没有脊髓损伤。SCI组及曲克芦丁组:参照Allen’s打击法建立脊髓损伤模型。2.曲克芦丁组:在脊髓损伤后30min以尾静脉注射曲克芦丁注射液,6mg/kg,每天1次,连续注射4周。SCI组及Sham组给予等量0.9%氯化钠注射液尾静脉注射,每天1次,连续4周。3.通过使用Basso,Beattie和Bresnahan(BBB)运动评定量表在手术后1、2、4周进行后肢运动功能评估。4.通过脊髓组织切片HE染色,用光学显微镜观察脊髓组织局部微循环情况。结果1.术前3组SD大鼠BBB评分均为21分;术后Sham组BBB评分与术前BBB评分相同,任意观察时间点其BBB评分均显著高于曲克芦丁组及SCI对照组。2.术后用药第1周,SCI对照组与曲克芦丁组BBB评分无统计学意义。3.术后用药第2、4周BBB评分显示,曲克芦丁组大鼠下肢运动功能明显好于SCI组(P<0.05)。4.Sham组大鼠脊髓组织形态结构完整,细胞形态完整,分布均匀;5.SCI组脊髓内有大量空泡,部分神经元溶解,周围可见少量炎症细胞浸润,脊髓结构排列紊乱,胶质瘢痕生成;6.曲克芦丁组脊髓组织空泡减少,同时可见损伤部位血管增生。结论通过对大鼠下肢运动功能BBB评分,我们发现在曲克芦丁治疗2周后,曲克芦丁组大鼠BBB评分高于SCI组,治疗4周后两组间差异更明显。通过HE染色我们发现曲克芦丁组脊髓组织空泡减少,同时可见损伤部位血管增生,脊髓损伤大鼠运动功能的恢复可能与曲克芦丁在脊髓损伤后的慢性期,促进损伤区域血管增生,改善脊髓损伤部位的微循环、降低凋亡因子的表达有关,从而达到保护神经的作用。二:曲克芦丁对大鼠脊髓损伤组织基因表达的影响目的为了检测曲克芦丁对脊髓损伤大鼠的保护作用的分子机制,收集SCI对照组及曲克芦丁治疗4周后的曲克芦丁组大鼠损伤处脊髓组织进行转录组测序。用Western blot验证差异基因caspase 6在各组脊髓组织中的表达。方法1.曲克芦丁治疗脊髓损伤大鼠后4周,收集曲克芦丁组及SCI对照组损伤处脊髓组织送公司进行转录组测序。2.在Hiseq X Ten测序平台,进行转录组测序。3.为了确保结果的可重复性和可靠性,在分析不同阶段有针对性地应用质量控制检查。4.用edge R软件筛选差异表达基因,用go_enrichment软件分析差异表达基因GO功能及KEGG通路富集。5.验证差异表达基因caspase 6的表达,收集完成各组脊髓组织后取出放入裂解液和蛋白酶抑制剂混合液中。6.经过研磨、低温离心、取上清液等过程,最后BCA试剂盒测蛋白浓度后,进行电泳、转膜、封闭。7.在4℃孵育一抗12 h,在室温下孵育二抗2 h;8.曝光仪曝光并用Image J分析各组条带灰度值。结果1.数据质量控制该文库碱基分布均匀,N%在合理范围之内;符合后续的分析要求。2.曲克芦丁显著改变损伤脊髓的基因表达曲克芦丁治疗4周后,曲克芦丁组差异基因m RNA水平的表达显著升高(P<0.05)。与SCI组相比,曲克芦丁组有261个差异表达基因,其中上调217个,下调44个。3.Western blot检测结果显示,SCI组caspase 6的表达量最高,曲克芦丁组caspase 6蛋白表达较SCI组表达显著下降(P<0.05),但高于Sham组。4.差异表达基因GO和KEGG通路富集分析本实验通过GO和KEGG数据库对261个差异基因进行功能注释,发现曲克芦丁注射液治疗损伤脊髓后富集与血管和神经相关有意义的GO的通路有骨骼系统发育、血管系统发育和对外界刺激的反应;曲克芦丁治疗脊髓损伤与富集有意义的KEGG的通路有Wnt、Hippo和Apoptosis等信号通路。结论1.我们通过m RNA测序的差异基因分析,发现与SCI组相比,曲克芦丁组有261个差异表达基因,其中217个上调,44个下调。2.GO和KEGG富集分析示,曲克芦丁组主要富集在Wnt、Hippo和TGF-β、Apoptosis等信号通路,提示曲克芦丁对SCI的保护作用机制比较广泛。3.Western blot结果证实了在曲克芦丁治疗4周后,曲克芦丁组caspase 6蛋白表达较SCI组表达显著下降。结果提示曲克芦丁可通过抑制细胞凋亡途径,减少凋亡蛋白酶caspase 6的表达,从而达到促进脊髓损伤恢复的作用。凋亡在脊髓损伤过程中起着重要的作用,脊髓损伤后因脊髓缺血、缺氧可导致局部内环境失衡、细胞坏死、诱导细胞凋亡,从而导致损伤范围扩大,损伤程度加重。故通过抑制神经细胞的凋亡途径可对脊髓损伤引起的运动功能损伤产生保护作用。