人脑胶质母细胞瘤是中枢神经系统中常见的恶性肿瘤之一,它具有高度血管化的特征,患者中位生存期一般不超过12个月。尽管人类在癌症的生物学研究和治疗方面取得了很大的进展,但是,我们对胶质瘤这种恶性程度较高的肿瘤的研究尚未深入,其确切的发病机制仍然不清楚,临床上治疗以手术切除为主,术后再加以放化疗以及免疫治疗等,总体治疗效果较差,肿瘤复发率高。因此,探讨胶质母细胞瘤发生发展的分子机制具有十分重要的意义。Mi RN A(Micro RNA)是一类非编码RN A,它是在真核生物中发现的,具有调控功能,其大小长约20~25个核苷酸【1】,它参与多种调节途径,例如发育过程、造血过程、细胞增殖与凋亡等等【2、3】。研究表明,mi RNA与胶质瘤的发生发展密切相关,它可通过调控其靶基因参与的信号通路进而在胶质瘤的发生和发展中发挥致癌或者抑癌的作用【1】,mi RNA可作为今后胶质瘤分子治疗方向上一个新的突破点。VHL(Von Hippel-Lindau)基因最早是由Von Hippel【4】及Linda【5】发现,是一种重要的肿瘤抑制基因【6、7】,定位于3p25~26区【7】,编码213个氨基酸的蛋白质,称为VHL蛋白,VHL基因突变与多种肿瘤的发生相关,例如肾细胞癌、嗜铬细胞瘤、胰腺癌、中枢神经系统血管瘤等【8】,VHL与胶质瘤之间的关系主要为VHL可参与HIF-1α泛素化降解的过程【9、10】进而影响VEGF(vascular endothelial growth factor)的表达,而VEGF在胶质瘤的发生发展过程中是最为重要的血管形成因子【11】。VHL除了调节HIF-α水平和抗血管生成外,还具有调节细胞凋亡【12】、细胞周期【13】、细胞外基质的作用【14】。我课题组前期研究工作提示VHL基因在胶质母细胞瘤中表达降低,并与患者生存期存在负相关(尚未发表数据),在对胶质瘤患者的研究中发现,mi R-566与胶质瘤发生、恶性程度、愈后密切相关【9】,生物信息学预测VHL基因受mi R-566调控(www.targetscan.org)。因此,在mi R-566、VHL和VEGF之间可能存在某种调控关系,该种调控关系对胶质瘤的发生发展发挥重要的作用。本研究将探讨mi R-566调控VHL对人脑胶质瘤中VEGF表达的影响,探寻新的有可能成为胶质瘤治疗的靶点,能够为胶质瘤的综合治疗提供更新的有效的方法和思路。本课题研究内容将分为以下两个部分:第一部分为mi RNA-566在人脑胶质瘤细胞中调控VHL影响VEGF表达的研究。我们首先用表达反义mi R-566的慢病毒(lenti-AS-mi R-566)侵染U87胶质瘤细胞,采用Real time PCR检测mi RNA-566及VEGF m RNA的表达,采用Western blot检测VHL、HIF-1α、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表达。其次用VHL表达质粒转染U87胶质瘤细胞,Western blot检测VHL、HIF-1α、VEGF蛋白的表达情况。最后采用荧光素酶报告基因实验验证mi R-566与VHL之间的调控关系。结果显示lenti-AS-mi R-566处理组U87细胞中mi RNA-566、VEGF m RNA和HIF-1α、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白的表达显著降低,VHL蛋白表达增高;VHL表达质粒转染U87胶质瘤细胞后,VHL蛋白的表达增高;HIF-1α和VEGF蛋白的表达下降,荧光素酶报告基因实验结果显示VHL是mi R-566的调控靶点,表明mi RNA-566在U87胶质瘤细胞中可直接调控VHL基因影响HIF-1α的表达,进而影响胶质瘤细胞中VEGF的表达,并且对胶质瘤细胞的侵袭性产生影响。第二部分为构建裸鼠颅内模型,进一步验证mi RNA-566在体内调控VHL影响VEGF的表达。用lenti-AS-mi R-566处理后的U87细胞建立裸鼠颅内模型,利用荧光原位杂交法(FISH)和免疫组织化学染色法对颅内模型组织切片中mi R-566和相关蛋白表达进行检测。结果显示组织切片中,荧光原位杂交证实处理组mi R-566表达减少,免疫组织化学染色证实处理组VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低,VHL蛋白表达增高,再次验证mi RNA-566可直接调控VHL基因的表达进而影响胶质瘤中VEGF的表达,并影响胶质瘤的侵袭性。结论:通过荧光素酶实验和蛋白免疫印迹检测实验,我们证实了VHL基因是mi R-566的靶基因,通过体内和体外实验的研究,我们发现抑制mi R-566的表达可以使HIF-1α、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白的表达显著降低,VHL蛋白表达增高;上调VHL的表达,可以抑制HIF-1α和VEGF的表达。这些数据表明:mi R-566可通过调控VHL基因进而影响VEGF的表达,并对胶质瘤细胞的侵袭性产生影响。