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结核病(Tuberculosis, TB)是危害人类健康的主要传染病之一,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病的病原体。结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组全长为4411532 bp,含有4044个基因,其中272个基因编码未知功能的蛋白质,1051个基因编码具有保守序列的假定蛋白质(Conserved hypothetical protein)。结核分枝杆菌的细胞壁是其赖以生存的重要屏障,可以作为研发抗结核药物的靶标。分枝杆菌的细胞壁主要由肽聚糖、聚阿拉伯糖半乳糖和分枝菌酸三部分组成,其中聚阿拉伯糖半乳糖(Arabinogalactan, AG)是细胞壁的重要组成成分。阿拉伯糖基的活性供体是聚十异戊二烯磷酸阿拉伯糖(Decaprenyl-phospho-arabinose, DPA)。近几年,随着Rv3806c、Rv3790、Rv3791蛋白功能揭示,DPA特异的合成途径逐渐被阐明。其由三个连续反应组成:(1)磷酸核糖转移酶(Rv3806c)将5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)转移到聚十异戊二烯磷酸(DP)分子上形成5-磷酸核糖聚十异戊二烯磷酸(5-P-DPR);(2)磷酸酶将5-P-DPR分子上的5-磷酸基团水解后形成聚十异戊二烯磷酸核糖(DPR);(3)差向异构酶(Rv3790、Rv3791)催化DPR生成DPA。在此途径中,催化5-P-DPR脱磷酸的磷酸酶未被鉴定。而与Rv3806c处于同一启动子的Rv3807c是一种由166个氨基酸组成的未知功能的膜蛋白,通过蛋白结构域预测其具有磷酸酶活性,该蛋白被推测催化5-P-DPR生成了DPR。本论文的目的是(1)克隆结核分枝杆菌Rv3807c基因。(2)在大肠杆菌中表达Rv3807c基因。(3)确定Rv3807c基因的表达产物是否具有磷酸酶活性,是否参与催化5-P-DPR生成DPR这一反应。本论文使用的方法与获得的结果:1.用PCR方法扩增目的基因Rv3807c从结核分枝杆菌基因组数据库中获得TB Rv3807c基因的核苷酸序列,并以此设计PCR引物,在上下游引物中引入NdeI和BamHI两个限制性酶切位点。用高保真DNA聚合酶以H37Rv基因组为模板成功扩增出Rv3807c基因。2.构建克隆载体pMD18T-Rv3807c纯化PCR产物,并将其与pMD18T载体进行连接,然后将连接产物转化入大肠杆菌Novablue的感受态细胞中。用限制性内切酶鉴定重组质粒。3. Rv3807c核苷酸序列的测定将pMD18T-Rv3807c重组质粒进行核苷酸序列测定,并进行BLAST分析,不存在任何碱基突变。4.表达载体pET16b-Rv3807c与pCold-Rv3807c的构建用NdeI和BamHI双酶切pMD18T-Rv3807c重组质粒,回收、纯化Rv3807c基因,并通过NdeI和BamHI两个限制性酶切位点与表达载体pET16b和pCold连接,将重组质粒pET16b-Rv3807c和pCold-Rv3807c通过NruI单酶切与NdeI和BamHI双酶切两种酶切方法进行鉴定。5. Rv3807c基因在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)和Er2566(DE3)中表达并用SDS-PAGE和Western blotting方法检测将重组质粒pET16b-Rv3807c转化到BL21(DE3)和Er2566(DE3)感受态细胞中,以及重组质粒pCold-Rv3807c转化到BL21(DE3)感受态细胞中,并用SDS-PAGE和Western blotting方法检测,结果表明Rv3807c在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)和Er2566(DE3)中成功表达。6.用Ni-NTA-Agarose亲和柱层析尝试纯化在大肠杆菌中Rv3807c基因过表达的蛋白。7.用超速离心方法提取Rv3807c基因表达的膜蛋白,并用SDS-PAGE和Western blotting方法进行检测。8. Rv3807c蛋白质酶活性的测定薄板层析(TLC)法:以DP与PRPP作为底物,加入Rv3807c表达的蛋白质后,中间产物5-P-DPR与终产物DPR量的变化,其中需要磷酸转移酶Rv3806c过表达蛋白质的参与。本论文利用分子克隆技术对结核分枝杆菌Rv3807c基因进行克隆,并使其在大肠杆菌中进行了可溶性表达,通过超速离心提取出Rv3807c基因表达的膜蛋白,并用薄板层析的方法对该蛋白质的功能进行检测。初步实验证明Rv3807c基因产物具有磷酸酶活性,使5-P-DPR脱磷酸生成DPR。本课题通过对Rv3807c基因功能的研究,对阐明DPA的合成途径提供了新的依据。