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目的基于“肾主骨，生髓”理论，通过研究滋补肾阴和温补肾阳的代表方剂左归丸和右归丸诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化，比较左归丸与右归丸对骨髓间充质干细胞的成骨分化作用的不同，并试图从MAPK/TGF-β1/Smads信号级联对其的影响，从而阐明代表滋补肾阴法的方剂左归丸和代表温补肾阳法的方剂右归丸与骨形成的关系。材料与方法采用血清药理学方法，将SPF级SD大鼠210只（210±10g），按体重随机分为七组：左归丸组、右归丸组、共同药组、滋阴药组、补阳药组、补佳乐组、空白对照组，30只/组，雌雄各半。按每kg体重大鼠的给药量为人的6.3倍计算，灌胃2次/日，空白对照组灌服蒸馏水，于第4d给药2h后，麻醉后，采用大鼠腹主动脉取血，静置2h后，离心（2500r·min-1，4℃，20min），收集血清，56℃水浴灭活30min，制备大鼠含药血清。首先采用Thermo(4.6×250mm,5μm)色谱柱；以乙腈：水=11:89为流动相；流速为1.0mL·min-1；波长为240nm；柱温为30℃的条件进行左、右归丸及其拆方体内外马钱苷的检测。再分别以各组含药血清加诱导剂（地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠），及诱导剂组共8组干预BMSCs（采用全骨髓贴壁法体外分离和培养），采用改良钙钴法检测碱性磷酸酶（ALP）活性，茜素红法观察矿化结节的形成，并用realtime RT-PCR法检测核心结合因子（Cbfα1）、Ⅰ型胶原（COLⅠ）mRNA表达，用Western blot法检测Cbfα1、COLⅠ蛋白表达。另外，从上述结果中得到较好的三组左归丸组、右归丸组、滋阴药组，加上空白对照组进行以下实验。ERK通路研究，细胞实验分组为空白对照组（Control）、空白对照+PD98059组（Control+PD）、左归丸组（ZGW）、左归丸+PD98059组（ZGW+PD）、右归丸组（YGW）、右归丸+PD98059组（YGW+PD）、滋阴药组（ZYY）、滋阴药+PD98059组（ZYY+PD）；JNK通路研究，细胞实验分组为空白对照组（Control）、空白对照+SP600125组（Control+SP）、左归丸组（ZGW）、左归丸+SP600125组（ZGW+SP）、右归丸组（YGW）、右归丸+SP600125组（YGW+SP）、滋阴药组（ZYY）、滋阴药+SP600125组（ZYY+SP）。第4代BMSCs接种24h后饥饿培养，24h后吸弃α-MEM培养液，加入含或不含10μM PD98059或10μM SP600125的基础培养液，预孵育细胞30min，加入各组含药血清，体积分数为10%，继续培养9d。采用改良钙钴法检测各组细胞的ALP活性，茜素红染色检测矿化结节的形成，实时荧光定量RT-PCR检测β1转化生长因子（TGF-β1）、Smad4、Cbfα1、COLⅠ基因的表达，Western blot方法检测TGF-β1、Smad4、Cbfα1、COLⅠ、p-ERK1/2和p-JNK蛋白的表达。结果1左、右归丸及其拆方体内外马钱苷的检测结果显示，马钱苷标准品出峰时间为13.057，在各组原液和含药血清中，左归丸、右归丸、共同药和滋阴药原液组及含药血清组均可以检测到马钱苷，而补阳药原液及含药血清组和空白血清组检测不到马钱苷成分。2左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs成骨分化的研究2.1左、右归丸及其拆方含药血清在BMSCs成骨过程中的作用ALP活性的增强和矿化结节的形成分别是骨形成的早期和中晚期的标志，因此，左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs ALP活性和矿化结节的影响，体现了左、右归丸及其拆方对BMSCs成骨分化的作用。2.1.1左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs ALP活性的影响结果显示：与Control组和YDJ组比较，ZGW+YDJ、ZYY+YDJ组能显著的促进BMSCs ALP活性的增强（P <0.05）；同时，ZGW+YDJ组促进BMSCs ALP活性的表达优于其他组，但与ZYY+YDJ组无明显差异（P<0.05）。2.1.2左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs矿化结节的影响结果显示：与Control组和YDJ组比较，ZGW+YDJ、ZYY+YDJ组能显著的促进BMSCs矿化结节的形成（P<0.05）；同时，ZGW+YDJ组促进BMSCs矿化结节的形成的能力优于其他组，但与ZYY+YDJ组无明显差异（P<0.05）。2.2左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs Cbfα1和COLⅠ的影响Cbfα1是BMSCs成骨分化的关键转录因子，是骨形成最早最特异性的标志，而COLⅠ是矿化骨中唯一的胶原类型，也是骨形成的重要标志，可见左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs Cbfα1和COLⅠ的影响，同样体现了体现了左、右归丸及其拆方对BMSCs成骨分化的作用。2.2.1左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs的Cbfα1mRNA和蛋白表达的影响结果显示：与Control组和YDJ组比较，ZGW+YDJ、ZYY+YDJ组均能上调Cbfα1mRNA和蛋白的表达（P<0.05）；同时，ZGW+YDJ组促进BMSCs Cbfα1mRNA和蛋白的表达能力优于其他组，但与ZYY+YDJ组无明显差异（P<0.05）。2.2.2左、右归丸及其拆方含药血清对BMSCs的COLⅠ mRNA和蛋白表达的影响结果显示：与Control组和YDJ组比较，ZGW+YDJ、ZYY+YDJ组均能上调COLⅠmRNA和蛋白的表达（P<0.05）；同时，ZGW+YDJ组促进BMSCs COLⅠmRNA和蛋白的表达能力优于其他组，但与ZYY+YDJ组无明显差异（P<0.05）。3左、右归丸含药血清通过调控ERK/TGF-β1/Smads信号级联促进BMSCs的成骨分化3.1左、右归丸含药血清通过ERK信号通路对BMSCs的成骨分化的影响3.1.1左、右归丸含药血清对BMSCs p-ERK蛋白表达的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著增强BMSCs的p-ERK蛋白表达；与ZGW组比较，YGW组增强BMSCs的p-ERK蛋白的表达能力减弱；另外，加入PD98059后，各组与未加PD98059比较，p-ERK表达显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。3.1.2左、右归丸含药血清通过ERK信号通路对BMSCs ALP活性的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组可以使棕黑色颗粒增多，显著增强ALP活性；与ZGW组比较，YGW组促进BMSCs的ALP活性的表达相对减弱；加入PD98059后，各组与未加组比较，细胞突触明显回缩，棕黑色颗粒沉积减少，ALP活性的表达均有所减弱(P＜0.01or P＜0.05)。3.1.3左、右归丸含药血清通过ERK信号通路对BMSCs的矿化结节的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组可以显著促进BMSCs矿化结节的形成；与ZGW组比较，YGW组和ZYY组促进BMSCs的矿化结节的形成相对减弱；加入PD98059后，各组与未加组比较，矿化结节明显减弱(P＜0.01or P＜0.05)。3.1.4左、右归丸含药血清通过ERK信号通路对BMSCs Cbfα1mRNA和蛋白的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著上调BMSCs的Cbfα1mRNA和蛋白的表达；与ZGW组比较，YGW组上调BMSCs的Cbfα1mRNA和蛋白的表达能力减弱；另外，加入PD98059后，各组与未加PD98059比较，COLⅠmRNA和蛋白的表达显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。3.1.5左、右归丸含药血清通过ERK信号通路对BMSCs COLⅠ mRNA和蛋白的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著上调BMSCs的COLⅠ mRNA和蛋白的表达；与ZGW组比较，YGW组上调BMSCs的COLⅠ mRNA和蛋白的表达能力减弱，而ZYY组仅上调BMSCs的COLⅠ mRNA表达能力减弱；另外，加入PD98059后，各组与未加PD98059比较，COLⅠ mRNA和蛋白的表达显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。3.2左、右归丸含药血清通过ERK/TGF-β1/Smads信号级联对BMSCs的成骨分化的影响3.2.1左、右归丸含药血清通过ERK/TGF-β1/Smads信号级联对BMSCs TGF-β1mRNA和蛋白的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著上调BMSCs的TGF-β1mRNA和蛋白表达；与ZGW组比较，YGW组上调BMSCs的TGF-β1mRNA和蛋白表达能力减弱，而ZYY组仅增强BMSCs的TGF-β1蛋白表达能力减弱；另外，加入PD98059后，各组与未加PD98059比较，TGF-β1mRNA和蛋白表达显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。3.2.2左、右归丸含药血清通过ERK/TGF-β1/Smads信号级联对BMSCs Smad4mRNA和蛋白的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著上调BMSCs的Smad4mRNA和蛋白表达；与ZGW组比较，YGW组上调BMSCs的Smad4mRNA和蛋白表达能力减弱，而ZYY组仅增强BMSCs的Smad4mRNA表达能力减弱；另外，加入PD98059后，各组与未加PD98059比较，Smad4mRNA和蛋白表达显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。4左、右归丸含药血清通过调控JNK/TGF-β1/Smads信号级联促进BMSCs的成骨分化4.1左、右归丸含药血清通过JNK信号通路对BMSCs的成骨分化的影响4.1.1左、右归丸含药血清对BMSCs p-JNK蛋白的表达的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著增强BMSCs的p-JNK蛋白表达；与ZGW组比较，YGW组和ZYY组增强BMSCs的p-JNK蛋白的表达能力减弱；另外，加入SP600125后，各组与未加SP600125比较，p-ERK表达显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。4.1.2左、右归丸含药血清通过JNK信号通路对BMSCs ALP活性的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组可以使棕黑色颗粒增多，显著增强ALP活性；与ZGW组比较，YGW组促进BMSCs的ALP活性的表达相对减弱；加入SP600125后，各组与未加组比较，细胞突触明显回缩，棕黑色颗粒沉积减少，ALP活性的表达均有所减弱(P＜0.01or P＜0.05)。4.1.3左、右归丸含药血清通过JNK信号通路对BMSCs矿化结节的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组可以显著促进BMSCs矿化结节的形成；与ZGW组比较，YGW组促进BMSCs的矿化结节的形成相对减弱；加入SP600125后，各组与未加组比较，矿化结节明显减弱(P＜0.01or P＜0.05)。4.1.4左、右归丸含药血清通过JNK信号通路对BMSCs Cbfα1mRNA和蛋白的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著增强BMSCs的Cbfα1mRNA和蛋白表达；与ZGW组比较，YGW组和ZYY组上调BMSCs的Cbfα1mRNA和蛋白的表达能力减弱；另外，加入SP600125后，各组与未加SP600125比较，Cbfα1mRNA和蛋白的表达能力显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。4.1.5左、右归丸含药血清通过JNK信号通路对BMSCs COLⅠ mRNA和蛋白的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著上调BMSCs的COLⅠmRNA表达，显著增强BMSCs的COLⅠ蛋白的表达；与ZGW组比较，YGW组上调BMSCs的COLⅠmRNA表达能力和增强BMSCs的COLⅠ蛋白的表达减弱，而ZYY组仅上调BMSCs的COLⅠ mRNA表达能力减弱；另外，加入SP600125后，各组与未加SP600125比较，COLⅠ mRNA和蛋白表达显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。4.2左、右归丸含药血清通过JNK/TGF-β1/Smads信号级联对BMSCs的成骨分化的影响4.2.1左、右归丸含药血清通过JNK/TGF-β1/Smads信号级联对BMSCs TGF-β1mRNA和蛋白的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著增强BMSCs的TGF-β1mRNA和TGF-β1蛋白表达；与ZGW组比较，YGW组和ZYY组增强BMSCs的TGF-β1mRNA和蛋白的表达能力减弱；另外，加入SP600125后，各组与未加SP600125比较，TGF-β1mRNA和蛋白的表达能力显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。4.2.2左、右归丸含药血清通过JNK/TGF-β1/Smads信号级联对BMSCs Smad4mRNA和蛋白的影响结果显示：与Control组比较，ZGW组，YGW组和ZYY组均显著增强BMSCs的Smad4mRNA和Smad4蛋白表达；与ZGW组比较，YGW组上调BMSCs的Smad4mRNA和蛋白的表达能力减弱，而ZYY组仅上调Smad4mRNA的表达减弱；另外，加入SP600125后，各组与未加SP600125比较，Smad4mRNA和蛋白的表达能力显著下调(P＜0.01or P＜0.05)。结论1左、右归丸及其拆方含药血清仍保留有其原形成分之一马钱苷，说明左、右归丸及其拆方原液和含药血清的成分部分存在一致性。2左、右归丸及其拆方含药血清能协同诱导剂促进BMSCs成骨分化，左归丸和滋肾阴药促进BMSCs成骨分化的作用为佳，进一步说明以“滋补肾阴”立法的左归丸组和滋肾阴药组优于以“温补肾阳”立法的右归丸组和补肾阳药组。3左、右归丸含药血清可通过ERK、JNK/MAPK信号通路调控BMSCs的成骨分化。4滋补肾阴法和温补肾阳法的代表方剂左、右归丸均可以通过调控ERK、JNK/TGF-β1/Smads信号级联促进BMSCs的成骨分化。