背景：肺癌是世界范围内肿瘤导致死亡的首要因素，近年来，肺癌的发病率和死亡率仍在不断攀升，经典的放化疗等治疗手段对肺癌的复发和转移的治疗效果不佳。新血管生成在肿瘤复发和转移的过程中起着重要的作用，针对肿瘤新生血管的治疗取得一定的效果，但仍存在不足。以往肿瘤血管新生研究中，大多采用诱导正常组织来源的内皮细胞肿瘤化来构建实验室肿瘤内皮细胞模型，不能如实反映肿瘤血管新生的过程及机制。因此，分离和培养肿瘤来源血管内皮细胞在研究肿瘤血管生成中具有更重要意义。CD105是增殖和缺氧诱导相关蛋白，主要高表达于新生血管内皮细胞(ECs)上，是新生血管内皮细胞的一种良好的新标记。选择CD105作为肿瘤来源的微血管内皮细胞分选标记，有望分离出更接近于肿瘤微环境下的血管内皮细胞用于后续系列研究。iTRAQ技术是一种全新的蛋白质组学技术，能够进行绝对和相对定量，检测结果精确并具有良好的可重复性，弥补了传统技术的不足。其在肿瘤微血管内皮细胞与正常来源内皮细胞比较蛋白质组学方面的应用鲜有报导。　　目的：分离、纯化肿瘤微环境中的CD105+微血管内皮细胞。通过iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白质组学技术，联合多种生物信息学分析及一系列细胞、分子生物学、免疫组织化学手段，分析不同来源的微血管内皮细胞不同的细胞、分子特征，探究肿瘤微环境对内皮细胞的影响，建立不同来源细胞的表达蛋白质组，筛选相应的特异蛋白标志物。　　方法：采用酶消化法、差速贴壁法和抗CD105免疫磁珠分选法，从新鲜肺鳞癌、腺癌临床组织手术标本中分离和纯化癌组织(TEC、TEC-2)、癌旁组织(距离癌组织＜3cm，PEC)、正常组织(距离癌组织最远端，＞5cm，NEC)来源的微血管内皮细胞。结合细胞免疫荧光、流式细胞术和RT-PCR技术对原代细胞表面CD31、CD144、CD105、VEGFR1、APN阳性表达和ITGAM(CD11b)、CD45、ACTA2(α-SMA)阴性表达及分选纯度进行鉴定。通过iTRAQ-2DLC-MS/MS蛋白质组学技术，联合多种生物信息学分析和一系列细胞、分子生物学手段，分析不同来源的微血管内皮细胞特性差异，肿瘤微环境诱导的蛋白质组表达差异。最后，针对癌旁这一临界组织特殊性，探索其来源微血管内皮细胞蛋白表达特点，在协助肿瘤血管生成中的作用及潜在的分子机制。　　结果：成功分离和培养出肿瘤来源血管内皮原代培养细胞用于微血管内皮细胞鉴定、Real-time RT-PCR、westem blotting等检测。检测表明本实验建立的酶消化法、200目筛网过滤、差速贴壁法结合两次抗CD105免疫磁珠分选可以获得高纯度、细胞活性好的微血管内皮细胞，同时无平滑肌等杂细胞污染，可保证后续系列实验的准确性。肿瘤来源的内皮细胞有更强的乙酰化低密度脂蛋白摄取能力，表现出更强的细胞活性和细胞增殖能力。iTRAQ-2DLC/MS/MS获得1811个蛋白质定量信息（可信度＞99％）。蛋白表达差异＞1.5倍判定上调或下调变化。鳞癌各组中，PEC、TEC组与NEC相比共鉴定到差异蛋白分别为178和162个，其中有86个为相同蛋白，有38个蛋白在各组中均差异表达;肺腺癌各组中，TEC-2组鉴定到差异蛋白158个，其中有78个为PEC、TEC-2相同差异表达蛋白，有52个蛋白在各组中均差异表达;B2-H8组中，有25个相同蛋白较A1组差异表达。聚类分析结果表明，TEC、TEC-2(C3、F6)两组优先聚为一类，两者蛋白表达相似度最高，NEC的蛋白表达与其他7个样本差异最大。单独分析正常、癌旁、癌来源微血管内皮细胞三组则发现癌旁与肿瘤微血管内皮细胞间的蛋白表达有更高的相似性。多种生物信息学分析结果表明，这些差异蛋白显著集中于几个重要的信号通路，如:ECM细胞外基质受体相互作用、细胞黏附、磷脂酰肌醇信号通路、MAPK通路、Wnt通路、钙离子信号通路和神经信号传递通路。　　微血管内皮是一种异质性细胞，TEC细胞的异质性主要是通过肿瘤特殊的微环境赋予。肺腺癌和肺鳞癌在生物学行为上表现出很强的差异，比如肿瘤生长速度、转移风险、对放化疗的敏感性等。本论文则在蛋白表达水平解释两者差异:与NEC比较，TEC、TEC-2差异蛋白中有108个蛋白相同。而仅在鳞癌来源TEC中表达上调＞2倍的蛋白有5个，分别为:Histone H2A type1-H(HIST1H2AM)、Heterochromatin protein1 binding protein3(HP1BP3)、40Sribosomal protein S15(RPS15)、Glutamate-ammonia ligase(GLUL)和NAD(P)Hdehydrogenase，quinine1(NQO1)，主要涉及细胞核组装、出核转运、能量代谢和氧化应激反应;仅在腺癌来源TEC-2表达上调＞2倍的蛋白有3个，分别为:Cadherin-2(CDH2)、Nucleosome assembly protein1 like1(NAP1L1)和Piezo-typemechanosensitive ion channel component1(PIEZO1)，主要涉及细胞迁移、细胞核组装和新血管生成。　　PEC差异蛋白，既有与肿瘤来源组相同的蛋白，又有癌旁本身独有的差异变化蛋白，主要属于氧化还原调节、血小板脱颗粒/激活、血管生成、细胞功能、胆固醇处理、对外部/雌激素反应途径/糖皮质激素的刺激，以及与肌肉细胞通讯等，为肿瘤细胞的生长增加血管生成活化和信号传导。由此可见，癌旁来源的微血管内皮细胞在肿瘤微环境中发挥着构建血管、传递信息的重要作用。PEC特异的差异蛋白中，有一类包含于正向调控平滑肌迁移的生物功能，这个功能主要与三个蛋白在PEC中特异性表达上调密切相关，即NRP1、PDGFRB和IL6ST。在鳞癌和腺癌临床组织中，PDGFRB约72％的癌旁组织微血管内皮细胞阳性染色强于相匹配的正常组织和肿瘤组织;癌旁微血管内皮细胞NRP1的阳性染色显著强于匹配的肿瘤组织和正常组织，统计结果显示在94％标本癌旁组中均表达增强。　　结论：本论文经多次分离、培养，逐步摸索出一套从临床肺癌新鲜组织标本中，分离、纯化高细胞活性的CD105+微血管内皮细胞方法。以iTRAQ-2DLC/MS/MS建立不同来源微血管内皮细胞的蛋白质组，鉴定细胞异质性蛋白分子基础。这些蛋白主要与对肿瘤微环境的适应性调整、细胞代谢过程、氧化应激、氧化还原稳态、凋亡和血小板脱颗粒/激活相关。同时，细胞在肿瘤微环境中的位置不同，也表现出不同特性。NRP1和PDGFRB在正调控平滑肌细胞迁移，协助血管构建中扮演重要角色，有可能成为抗血管生成治疗的重要分子靶向。