LyGDI及其突变体对L929细胞生长、转移及放射敏感性影响的研究

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目的:LyGDI(27kDa),也称RhoGDI2、D4-GDI或RhoGDIβ,是Rho GDP解离抑制因子(RhoGDI)家族的主要成员之一,在细胞运动及侵袭的很多方面起到调节作用,包括细胞极化、细胞骨架组织及由外环境而来的信号转导。本实验研究了外源性LyGDI及其突变体D19LyGDI的引入,对于L929细胞生长、转移及放射敏感性等的影响及其作用机制,L929细胞为对裸鼠具有致瘤性的细胞株。方法:(1)用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法,将构建于pEGFP载体上的LyGDI、D19LyGDI及空载体pEGFP-C1转染入L929细胞,用G418筛选出稳定转染细胞株,而后激光共聚焦显微镜观察转染细胞中EGFP的表达,Western Blot检测融合蛋白的表达。(2)MTT法检测LyGDI及D19LyGDI对于L929细胞生长能力的影响。(3)体外划痕试验观察外源基因对于细胞侵袭及转移能力的影响。(4)克隆形成试验观察LyGDI及D19LyGDI的引入是否增加L929细胞的放射敏感性。(5)细胞经X射线照射后,流式细胞仪测周期,检测外源基因联合辐射对于细胞周期分布的影响。结果:(1)激光共聚焦显微镜观察结果表明,转染LyGDI、D19LyGDI及空载体pEGFP-C1的L929细胞中均可见EGFP发出的绿色荧光。(2) Western Blot结果证实,转染细胞中有相应融合蛋白的表达。(3)MTT检测表明,转染外源基因的细胞较对照组细胞相比,生长速度要慢,转染D19LyGDI的细胞最为明显。(4)体外划痕试验结果表明,转染细胞的运动性降低,转染D19LyGDI的细胞最为明显。(5)由克隆形成试验结果绘制剂量存活曲线表明,转染LyGDI及D19LyGDI的细胞的D0、Dq、SF2值均低于未转染细胞及转染空载体细胞,转染D19LyGDI的细胞各参数值最低。(6)各组细胞经4Gy X射线照射后,较未受照细胞相比,均可见G1期所占比例增加,且转染LyGDI的L929细胞所占比例的增加要比其余组明显。结论:建立了稳定转染细胞株;LyGDI及D19LyGDI的转入抑制了L929细胞的生长及侵袭、转移能力,且增加了细胞的放射敏感性,均以D19LyGDI明显;外源性引入的LyGDI促进了辐射诱导的G1期阻滞,增加了L929细胞的放射敏感性。
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