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目的:比较常氧与低氧培养条件下尿源性干细胞(urine-derived stem cell,USCs)的生物学特性差异,探讨低氧预处理能否促进USCs移植治疗小鼠慢性肝损伤模型及其可能的机制。方法:1.收集10名年龄为20~25岁的健康男性尿液样本,分离培养USCs,分析其生物学性状:显微镜下观察细胞形态、流式细胞术检测干细胞表面标记,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色、油红O染色、吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)摄取释放实验及过碘酸希夫(Periodic acid-Schiff,PAS)染色评估成骨、成脂、成肝分化潜能,激光共聚焦显微镜检测PKH26标记的USCs与PKH67标记的不同肝细胞在体外的融合能力。腹腔注射CCL4制备慢性肝损伤模型。造模12周后,移植组裸鼠尾静脉注射USCs,每周2次。第一次细胞注射2周后取材,计算肝脏指数,血生化检测血清天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)和丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase,ALT),HE及染色检测肝脏的病理变化,Masson染色染色评估肝脏的纤维化程度,冰冻切片检测荧光标记的USCs与肝细胞在体内的融合能力。2.比较常氧及低氧培养环境下USCs的细胞形态、生物学性状差异。裸小鼠制备慢性肝损伤模型,建模成功后尾静脉注射常氧及低氧预处理48h的USCs,每周2次,首次细胞注射两周后取肝脏组织,同上计算肝脏指数,检测AST和ALT,检测肝脏病理变化和肝脏纤维化,免疫组化检测纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),氧化应激相关蛋白MPO和8-OHdG的表达。3.常氧及低氧培养环境下透射电镜观察自噬小体及自噬溶酶体,Western Blot检测自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达,ptfLC3(dual-fluorescene mRFP-GFP-LC3)质粒转染细胞后共聚焦显微镜观察红绿荧光。给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和巴弗洛霉素(Bafilomycin,Baf)预处理3h后,细胞再置于低氧培养环境培养48h。台盼蓝拒染实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式检测细胞凋亡及细胞周期,划痕实验和transwell实验检测横向及纵向迁移能力。WB检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达,ALP染色、茜素红染色及油红O染色评估成骨成脂分化潜能。结果:第一部分:正常健康人的USCs为米粒状贴壁生长细胞,表达间充质干细胞表面特异性标志物。经成骨成脂诱导,ALP、茜素红染色及油红O染色阳性,与肝祖细胞分离共培养的USCs其ICG及PAS染色阳性,提示USCs有成骨成脂成肝分化潜能。PKH26标记的USCs在体外能与PKH26标记的肝细胞HP14-19和肝癌细胞HepG2进行细胞融合,融合细胞可见橙色荧光。与对照组相比,慢性肝损伤模型组肝脏指数显著增高(p<0.05),急性肝损伤标志ALT稍有增高(p>0.05),慢性肝损伤标志AST增高(p<0.05)。肝细胞退行性变表现为肝索结构紊乱、核固缩或消失,有较多岛屿状假小叶结构形成,汇管区有较多炎性细胞浸润,Masson染色显示门静脉周围有大量蓝色纤维化。USCs尾静脉移植组较造模组肝脏指数降低(p<0.05),ALT降低(p>0.05),AST降低(p>0.05);肝细胞退行性变及纤维化程度均有所改善。免疫荧光发现移植组肝脏内的外源性USCs阳性表达白蛋白(albumin,ALB),且在绿色荧光蛋白转基因小鼠中,PKH26标记的USCs被检测为GFP阳性细胞,表明USCs与肝细胞在体内具有细胞-细胞融合现象。第二部分:低氧培养条件下的USCs形态较常氧条件下更小更均一,且两种培养条件下USCs的CD Maker表达无明显差异,两组细胞均为对数增长趋势,低氧组细胞增殖及迁移能力更强(p<0.05)。低氧预处理48h后,S期细胞百分比显著增加(p<0.05),细胞凋亡率无明显变化(p>0.05)。经成骨、成脂和成软骨诱导,两组USCs的ALP、茜素红、油红O和阿利新蓝染色均为阳性且无明显差异。在慢性肝损伤模型中,低氧组的USCs在肝组织中定植的细胞数量较常氧组多(p<0.05)。USCs移植后,肝指数和ALT无明显改善(p>0.05),血清AST部分修复(p<0.05),但常氧组与低氧组无明显差异(p>0.05)。HE及Masson染色显示USCs移植组较造模组肝脏病理结构紊乱得到了显著恢复,蓝色的胶原纤维明显减少,低氧预处理USCs组的蓝染较常氧USCs移植组少。正常肝脏中纤维化标志物α-SMA,氧化应激相关蛋白MPO和8-OHdG的基础表达很低,在模型组中其表达明显升高。USCs移植组α-SMA、MPO和8-OHdG显著降低,但常氧及低氧USCs移植组无明显差异。第三部分:低氧处理48 h后,电镜观察到USCs中出现大量双层膜或多层膜结构的自噬小体及其与溶酶体融合形成的自噬溶酶体,自噬标志蛋白Beclin1和LC3Ⅱ的表达增加。导入ptfLC3双荧光质粒,共聚焦结果显示低氧处理组的黄色斑点(指示自噬小体)以及红色斑点(指示自噬溶酶体)均明显多于常氧组,提示低氧处理能显著增强USCs的自噬水平。用3-MA和Baf抑制自噬后,LC3Ⅱ、Beclin1和P62的表达在3-MA和Baf处理组显著降低,细胞增殖显著降低,细胞克隆数量减少,克隆平均直径显著变小(p<0.05),尤其是Baf组。3-MA和Baf处理组划痕愈合时间较低氧组延长,transwell迁移细胞数比低氧组明显减少(p<0.05)。四组之间的细胞凋亡和细胞周期无明显差异。低氧预处理和细胞自噬水平改变不会影响USCs的分化潜能。结论:本研究证实尿源性干细胞具有与间充质干细胞相似的细胞表型,并且具有自我更新和多向分化潜能的特征。USCs移植到慢性肝损伤模型小鼠中可有效改善肝功能并在一定程度上修复肝脏组织损伤。低氧预处理可能通过诱导细胞自噬促进细胞增殖和迁移,进而提高USCs在损伤肝脏的定植存活率,增强USCs移植治疗的修复作用。通过非侵入性方法获得的自体尿源性干细胞可作为肝细胞移植的理想种子细胞来源,在慢性肝病的临床治疗中有潜在的应用前景。