背景恶性淋巴瘤(Malignant lymphoma,ML)为源自于淋巴结与其他淋巴造血组织的恶性肿瘤,可分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’S lymphoma,HL)与非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’S lymphoma,NHL)。其发病率女性和男性的分别居全球第全世界第五和第六位,该病已经严重威胁到人类的健康。NK/T细胞淋巴瘤(NK/T-Cell Lymphoma,NKTCL)则为非霍奇金淋巴瘤的一个类型,其发病率高,且分布具有一定的地域特点,主要在亚洲分布,且欧美发病人群也多为亚裔,并因肿瘤组织来源于NK细胞或者T细胞而得名。肿瘤较常累及淋巴结以外组织,比如鼻腔及鼻咽,其他部位如扁桃体、上颚等上呼吸道或者消化道也可发生,此外还可以累及皮肤、睾丸、脑及骨髓等,病情严重者可能出现嗜血细胞综合征,引起严重的临床的症状,例如全血细胞的减少、肝脏和脾脏的肿大、高热、黄疸以及多个器官的功能的损害。该类型淋巴瘤常侵犯血管,并能够释放穿孔素,故会有大量骨、软组织等坏死穿孔,引起相应脏器不可逆的功能障碍。该病的病因不确切,大量研究发现与EB病毒的慢性的感染密切相关。该病具有侵袭程度高,进展快速,预后差,生存期短等特点,即使达到完全缓解,后期很容易复发。疾病的早期大多预后较好,而中晚期患者则预后差,治疗也不确切。国际上目前尚无标准的一线治疗方案,近年来,随着研究的进展,以吉西他滨、培门冬酶为基础的DDGP化疗方案对NKTCL的疗效有了显著的提高。而NKTCL细胞多表达一些耐药的基因的m RNA,这种基因的产物如P糖蛋白则可以与一些化疗药物相结合,从而导致相应的治疗效果不理想。他汀类的药物为3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)的还原酶抑制剂,能够阻断甲羟戊酸的途径,该药物可减低胆固醇浓度,保护心血管系统。甲羟戊酸途径是维持细胞代谢活性的一个重要的细胞内通路,该途径的终产物包括胆固醇和多萜醇等。近年来,一些实验室和临床数据证明,他汀类药物除了能够降低胆固醇浓度,还对别的疾病的防治有利,例如,显著改善血管的内皮功能或稳定血管壁动脉粥样硬化的斑块、对抗炎症和免疫调节作用、保护神经、抗肿瘤、减少慢性肾脏病进展,其中抗肿瘤的特性也成为研究的热点。他汀类的抗癌特性在很多肿瘤细胞上都有研究,例如乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、白血病等。不仅如此,现有一些动物实验和前瞻性的临床试验,也证实了他汀类的药物能够降减少肿瘤发病率、降低肿瘤的发展、减慢其转移速度、逆转肿瘤的耐药等。他汀类的药物抗肿瘤的效果与药物的极性有很大的关系,亲脂性越强的他汀,越容易夸越细胞膜,作用于细胞内各种代谢途径,也表现出更为强烈的抗癌特性。其抑制肿瘤增殖主要通过两个方面的作用,包括细胞周期的阻滞以及诱导细胞的凋亡。大量的实验数据告诉我们此类的药物可以使细胞周期停滞在G1/S期边界。细胞凋亡存在两种途径发生,包括内在和外源性的途径,该类型的药物可以同时作用于这两种途径。内源性途径(线粒体途径)诱导的细胞的凋亡主要以Bcl-2家族的抗凋亡的蛋白及其前体的不平衡为表现,外源性途径主要表现为caspase-3、caspase-8、caspase-9的活化。在乳腺癌、前列腺癌、白血病等一系列的细胞中,均已发现他汀类药物可以诱导细胞的凋亡。本研究以NKTCL细胞株YTS和NKL做为研究对象,用不同的浓度的辛伐他汀(Simvastatin,SIM)和FLU(Fluvastatin,FLU)作用于细胞株,使用CCK8法检测细胞的增长和抑制情况,用流式细胞仪(Flow Cytometer,FCM)检测药物对细胞周期的影响,利用Annexin V-PI方法和Western blot法检测细胞的凋亡情况。后将FLU与GEM(Gemcitabine,GEM)联合,并使用CCK8及Western blot来检测两种药物作用后对细胞增殖和凋亡的影响。希望经过此次研究,可以了解他汀类的药物对NKTCL细胞是否有生长抑制作用,能否与细胞毒药物GEM联合协同地抗肿瘤,找到更为有效的治疗该疾病的方法。目的研究辛伐他汀和氟伐他汀对NKTCL细胞株YTS和NKL细胞增殖抑制的影响,并探索与吉西他滨联合用药的效果。材料和方法1.细胞的培养:YTS在含有10%的胎牛血清的1640培养基,NKL在含有10%的胎牛血清和白细胞介素-2中培养基,并放置于温度为37℃、含有5%CO2的培养箱中进行培养,每2-3天根据细胞状况更换或者添加适量培养液。2.CCK8检测:CCK8法检测不同浓度SIM和FLU作用后细胞增殖抑制水平以及FLU与GEM联合前后细胞的增殖抑制的水平。不同浓度SIM(0、5、10、25、50u M)以及FLU(0、5、10、25、50u M),分别作用YTS、NKL及正常人外周血单个核细胞,每组设3个复孔,分别作用48和72小时。与GEM联合的实验分组:(0、FLU 2.5u M、FLU 5u M、GEM 20n M、GEM 20n M+FLU2.5u M、GEM 20n M+FLU 5u M)作用于YTS 48小时,(0、FLU 2.5u M、FLU 5u M、GEM 2n M、GEM 2n M+FLU 2.5u M、GEM 2n M+FLU 5u M)作用于NKL 48小时。利用酶标仪来测定波长在450nm时的吸光度,得到相应的OD值,记录并计算平均值。3.FCM检测细胞周期:不同浓度FLU(0、5、25u M)作用于两株细胞株48小时后,按照测细胞周期的试剂盒来检测用药前后细胞周期的阻滞的情况。4.Annexin V-PI检测凋亡:FLU(0、5u M、25u M)作用于两株细胞48小时后,利用Annexin V-FITC的方法检测药物诱导的凋亡的水平。按照相关试剂盒说明书操作。5.Western blot法检测凋亡的相关蛋白:YTS和NKL两种细胞株在相同剂量的SIM和FLU(10u M)作用48小时后检测Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表达情况;FLU 5u M、GEM 20n M、GEM 20n M+FLU 5u M作用于YTS细胞株48小时,FLU 5u M、GEM 2n M、GEM 2n M+FLU 5u M作用于NKL细胞株48小时,后检测Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白的表达情况。6.采用SPSS21.0软件统计分析和绘图。各组的数据均以平均值±标准差来表示。两组数据的比较若方差齐,则采用t检验,若方差不齐,则采用t’检验。多组数据的比较采用单因素方差分析,多样本均数的两两比较采用LSD-t检验。P<0.05则认为有显著的统计学差异。结果1.SIM和FLU能够抑制YTS和NKL的细胞生长:SIM(5、10、25、50u M)对YTS细胞作用48小时后细胞的存活率由(92.30±1.07)%下降到(71.04±1.40)%,作用72小时后细胞的存活率分别为由(74.39±2.35)%下降到(54.12±2.83)%;(2)FLU(5、10、25、50u M)对YTS细胞作用48小时后细胞的存活率由(74.75±3.25)%下降到(28.67±1.16)%,作用72小时后细胞的存活率由(53.44±2.81)%下降到(24.26±3.21)%;(3)同等浓度梯度的SIM对NKL细胞作用48小时后细胞的存活率由(84.29±2.61)%下降到(70.82±2.56)%,作用72小时后细胞的存活率由(76.62±2.84)%下降到(40.97±2.23)%;(4)同等浓度梯度的FLU对NKL细胞作用48小时后细胞的存活率由(68.68±1.75)%下降到(29.86±1.61)%,作用72小时后细胞的存活率由(39.89±1.31)%下降到(18.54±1.03)%;(5)SIM和FLU对正常人外周血单个核细胞存活率没有显著影响。2.GEM与FLU联合用药有协同作用:2.5u M FLU、5u M FLU与20n M GEM联合作用YTS 48小时后细胞抑制率分别为(39.23±1.03)%、(49.81±2.01)%,高于单独应用FLU(19.96±1.89、25.84±0.12)%及GEM(13.45±0.97)%的增殖抑制率;2.5u M FLU、5u MFLU与2n M GEM联合作用NKL 48小时后细胞抑制率分别为(43.89±1.03)%、(51.68±2.47)%,高于单独应用FLU(19.60±1.74、31.67±2.01)%及GEM(19.62±1.15)%的抑制率。3.FLU能够导致细胞周期的阻滞:FLU(0、5、25u M)作用于YTS 48小时后G0/G1期的细胞比例由(41.15±4.59)%最大上升至(64.88%±2.17),S期比例由(43.39±5.77)%最大下降至(21.25±4.26)%;同等浓度梯度FLU作用于NKL 48小时后G0/G1期的细胞比例由(45.37±3.79)%最大上升至(69.59±4.33)%,S期比例由(34.02±6.04)%最大下降至(13.26±0.85)%。4.FLU能够诱导YTS和NKL的凋亡:(1)FLU作用于YTS和NKL细胞株后能够引起细胞凋亡;(2)FLU 5u M、25u M对YTS细胞作用48小时的凋亡率分别为(14.1±2.66)%、(34.5±5.67)%,FLU 5u M、25u M对NKL细胞作用48小时的凋亡率分别为(19.83±3.26)%、(37.17±5.62)%。5.FLU、SIM均能够引起凋亡相关蛋白表达的增多,且与GEM有协同作用:相同剂量的FLU和SIM作用于两细胞株,凋亡通路重要蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表达增高,且细胞对FLU比对SIM的反应更为敏感。FLU和GEM联合应用时凋亡相关蛋白的表达,比单用任何一种药时都增多。结论1.辛伐他汀和氟伐他汀能够抑制NKTCL细胞增殖。2.氟伐他汀与细胞毒性药物吉西他滨联合应用具有协同效应。