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池塘养殖作为我国淡水养殖产业中重要的组成部分,每年为我国提供了大量的水产品。在淡水养殖业快速发展的同时,也产生了一些环境问题,特别是抗生素的过量使用导致的环境当中抗生素抗性菌(ARB)和抗性基因(ARGs)的频繁出现,引起了各界学者的广泛关注。不管是养殖水源携带的污染物还是养殖过程残留的抗生素,都在一定程度上加速了ARGs在养殖场沉积物中的富集。由于水体具有高流动性,养殖场中的ARGs又会随着养殖废水进入水域环境,进一步对生态系统造成危害。因此,本研究对养殖池塘沉积物中细菌的群落结构、抗生素抗性菌、抗生素抗性基因的分布特点等方面进行研究,以期为池塘健康养殖和水域环境生态保护提供依据。本研究从安徽、福建、广西、海南和陕西等5个省份的多个水产养殖场中采集了池塘沉积物,通过基因克隆、实时定量PCR、宏基因组测序、药物平板筛选、16S r RNA高通量测序和模拟试验等方法研究了养殖池塘沉积物中的细菌、耐药菌和抗生素抗性基因的丰度和多样性,检测了从沉积物中分离得到的耐药大肠杆菌的耐药表型和耐药基因型;并探究了不同浓度次氯酸钠对养殖水体中可培养细菌的灭活和耐药基因的去除效率。通过网络分析和结构方程模型(SEM)等方法分析了细菌群落(门、属)和ARGs的共现模式,探究了影响ARGs产生的理化和生物因素。得到了以下研究结果:(1)所检测的养殖场沉积物中,丰度最高的细菌类群是变形菌门、其次是厚壁菌门、拟杆菌门、绿弯菌门和脱硫杆菌门,它们占到了全部细菌群落丰度的60%以上。福建养殖场的沉积物中检测到了较高丰度的Campilobacterota;而海南养殖场丰度最高的是Halobacterota。在属水平上,厌氧粘菌属(Anaeromyxobacter)、Geothermobacter为安徽养殖场沉积物中的优势属;假单胞菌属(Pseudomonas)、Sulfurimonas、Sulfurovum为福建养殖场沉积物中的优势属;Robiginitalea、Candidatus为广西养殖场沉积物中的优势属;甲烷杆菌属(Methanobacteria)、Methanoregula、Leptolinea为海南养殖场沉积物中的优势属;鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、硫杆菌属(Thiobacillus)为陕西养殖场沉积物中的优势属。(2)在陕西省不同区域的池塘沉积物中,发现了27种丰度较高的潜在致病菌。其中,在商洛的样品里,沙门氏菌属(Salmonella)、拉恩氏菌属(Larenella)、肠球菌属(Enterococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和气单胞菌属(Aeromonas)的相对丰度较高;安康样品中,分枝杆菌属(Mycobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、弓形杆菌属(Toxobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和嗜血杆菌属(Haemophilus)的相对丰度较高;合阳的样品中,蛭弧菌属(Bdellovibrio)、弯曲杆菌(Campylobacter)、李斯特菌属(Listeria)、优杆菌属(Eubacter)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的相对丰度较高;西安的样品中各类致病菌的相对丰度均较低。(3)从陕西省的4个养殖场沉积物中共获得了422种ARGs,它们包括氨基糖苷类、β-内酰胺类、多重耐药类、磺胺类、喹诺酮类和MLS等11大类ARGs,这些ARGs的耐药机制多数为外排泵机制和抗生素失活机制。在这422种ARGs中,β-内酰胺类抗性基因的数量最多,共检测出来120种;其次是多重耐药类抗性基因和氨基糖苷类抗性基因,分别检测出了59种和55种;数量最少的是利福霉素类抗性基因,只检测出了7种。SEM分析结果表明,沉积物中ARGs的丰度和多样性会受沉积物中TN、TP含量和细菌群落多样性的影响。Spearman相关性分析结果表明,沙门氏菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、蛭弧菌属等菌属与β-内酰胺类、MLS类、喹诺酮类和磺胺类等抗性基因呈现显著正相关;肠球菌属和链球菌属与利福霉素类抗性基因呈现显著正相关。(4)水产养殖场沉积物中分离得到的63株大肠杆菌均对多种抗生素组合表现出耐药性,其中,23株菌株表现出对多西环素+环丙沙星+氨苄西林组合的耐药性;19株表现出对土霉素+多西环素+氨苄西林组合的耐药性;17株表现出对土霉素+多西环素+环丙沙星组合的耐药性;4株表现出对土霉素+多西环素+头孢噻呋组合的耐药性。针对三种移动遗传元件的检测结果表明,在63株菌中共检测出了36个Intl1基因,9个Intl2基因,21个ISCR1基因;此外,有89%的分离株携带有8种及以上ARGs。(5)含有效氯3mg/L的次氯酸钠溶液能有效去除池塘水体中的可培养细菌;含有效氯9 mg/L的次氯酸钠对水中质粒ARGs有较好的去除效果,但无法完全清除掉水体中的质粒ARGs。综上所述,养殖场沉积物不仅作为ARGs的储库,同时也是某些潜在致病菌的储库。当前养殖池塘中ARGs的污染现状是由多种因素的长期影响造成的。通过向养殖场中合理的使用次氯酸钠,能够有效减少致病菌和ARGs向外界环境的传播的风险。