稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus kuschil)原产于北美,20世纪70年代入侵亚洲以来,范围不断扩大,是一种重要的水稻害虫。昆虫嗅觉和味觉在感受气味物质、寻找寄主、交配等方面起着重要的作用。G蛋白偶联信号传导系统是生物体内一类重要的细胞信号传导途径,参与了昆虫的嗅觉、视觉和内分泌激素等多种信号的传导过程。开展昆虫G蛋白的研究,不仅可以明确昆虫对信号分子的感受机理；还可以了解G蛋白对昆虫的行为和生理信号传导的调节作用,为今后深入研究病虫害信号传递机制和调控机理奠定理论基础。本研究克隆了稻水象甲G蛋白α亚基基因的读码框(ORF),并对序列特征及进化关系进行了分析,构建了该基因的原核表达载体pET30a/Gαo,用纯化后的蛋白免疫兔子制备了多克隆抗体,同时用荧光定量PCR研究了该基因转录水平的表达情况,并利用制备的抗体将G蛋白α亚基在稻水象甲触角进行了免疫定位。本文构建了稻水象甲头部cDNA文库,并通过酵母双杂交的方法筛选与G蛋白α亚基相互作用过的蛋白。研究结果如下：1.稻水象甲G蛋白α亚基基因的克隆和序列分析。利用RT-PCR和RACE方法从稻水象甲头部cDNA中克隆了一个G蛋白α亚基基因,Lo Gαo。该基因的ORF为1065个核苷酸,编码354个氨基酸残基,预测的分子量为40.416kDa,等电点为5.34。通过多序列比对、系统进化及相似性分析,发现这个G蛋白α亚基应属于Gαo家族,主要功能域和结合位点的氨基酸序列在与其他Go蛋白基本相同。我们推测Lo Gαo的功能可能与其他已报道的Gao蛋白相类似,可能结合相似的受体以及调控相同的下游效应器。2.稻水象甲Gαo基因的原核表达、多克隆抗体制备及其组织分布的Western blot检测。我们构建了Lo Gαo基因的原核表达载体pET30a/Gαo, IPTG诱导原核表达。用原核表达的蛋白制备了兔源多克隆抗体,并用Elisa和Western blot检测了该抗体的效价和特异性。Anti-Lo Gαo抗血清的效价为2.048×106,并且Western blot结果显示该抗体在稻水象甲各个组织的粗提液中只检测到一条40kDa的特异性条带,与其他G蛋白亚基没有交叉反应。我们制备的抗体的特异性和效价均符合下一步实验的要求,对于Lo Gαo在稻水象甲的免疫定位提供了必要的前提。3 Real-time PCR鉴定稻水象甲Gao基因的转录表达,用相对定量的方法,我们研究了稻水象甲各器官Lo Gαo转录水平上的表达谱,发现Lo Gao mRNA没有组织特异性,在各个组织都有表达,但是其在触角的表达显著高于其他部位。触角是昆虫感觉系统的重要组成部分,行使着嗅觉、味觉等功能,该基因在触角的高丰度表达,使我们推测其可能参与嗅觉或味觉的信号转导。4稻水象甲触角感器的扫描电镜观察,利用扫描电镜技术,我们观察了孤雌生殖和两性生殖稻水象甲触角感器的类型和分布；比较了两种生殖方式和雌雄之间的差异,并探讨了各类型感器的功能,为研究稻水象甲G蛋白α亚基在嗅觉感器上的定位奠定了基础。5稻水象甲Gαo亚基在触角感器中的免疫定位,利用本研究制备的anti-LoGαo多克隆抗体,用免疫胶体金标记的方法研究了稻水象甲G蛋白αo亚基在触角的定位情况,发现该亚基主要定位在毛型感器的树突神经中,根据本文第五章对触角感器功能的探讨,毛型感器可能是稻水象甲的味觉/嗅觉感器,该结果表明Lo Gαo可能参与稻水象甲味觉/嗅觉信号的转导过程。6酵母双杂交方法筛选与稻水象甲Gαo相互作用的蛋白,本文构建了稻水象甲头部的酵母cDNA文库,文库的滴度为6.8×109个细胞/ml文库(>2.0×107个细胞/ml),符合文库构建的要求,可用于进行下一步的酵母双杂交实验。用Gαo诱饵蛋白对稻水象甲头部cDNA文库的筛选之后,我们得到一些与α亚基相互作用的克隆,如肌球蛋白调节轻链激酶(myosin light chain kinase)、载脂蛋白D(apolipoprotein D)、肌球蛋白Ⅵ(mysinⅥ)、铁蛋白(ferritin)、山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase)、锌指蛋白(zinc finger protein)等。这些蛋白与稻水象甲Gαo的相互作用还需要进一步的验证。