白花丹醌对大鼠肝纤维化HSEC干预作用及其机制的研究

来源 :广西中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tiger_adan
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目的:研究白花丹醌对CCl4联合乙醇的大鼠肝纤维化模型干预作用,观察白花丹醌干预前后大鼠肝纤维化模型肝脏HSEC窗孔数目、基底膜结构变化,以及相关细胞因子内皮素-1(END-1)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)等干预前后的变化。进一步探讨白花丹醌逆转肝纤维化的机制,为白花丹醌治疗肝纤维化作出理论和实验依据。  方法:1.肝纤维化模型的制备:SD大鼠200只,雌性大鼠120只,雄性大鼠80只。随机抽取20只做空白对照组,空白对照组皮下注射生理盐水,2次/周,连续4周,用量0.3ml/100g。其它大鼠皮下注射40%CCl4花生油,用量0.3ml/100g,第一次注射量加倍,2次/周,连续4周,造模期间大鼠仅食用含10%乙醇饮水。4周后,随机抽取8只大鼠做肝组织病理HE染色,证实肝纤维化模型已经建立成功。然后将造模成功的肝纤维化大鼠随机抽取分组每组18只分别为:白花丹醌高剂量组,白花丹醌中剂量组,白花丹醌低剂量组,秋水仙碱组,丹参酚酸B组,模型对照组,分别继续造模并且同时灌胃给药。第11周末将大鼠全部处死进行解剖,取其肝脏和血液标本进行相关指标检测。  2.全自动生化仪分析血清ALT、AST、TBIL、ALP的含量变化。  3.放射免疫法测定血清HA、P3NP、LN、CIV含量变化。  4.HE染色肝组织观察肝纤维化程度及分期评分。  5.电子显微镜观察HSEC超微结构特征。  6.逆转录RT-PCR检测相关细胞因子mRNA含量的改变。  结果:第一部分白花丹醌干预肝纤维化大鼠模型后肝功能相关指标及 HE染色肝纤维化程度的改变  1.全自动生化仪分析血清ALT、AST、TBIL、ALP的含量变化:肝功能检测结果证实在第11周末用药各组与模型对照组比较,血清 ALT、AST、TBIL、ALP值均下降,均有极显著性差异(P<0.01);其中白花丹醌低剂量组第11周,随着用药时间的延长,ALT、AST、TBIL、ALP值逐渐降低,第11周末血清ALT、AST、TBIL值与秋水仙碱、丹参酚酸B阳性对照组比较,有显著性差异(P<0.05),ALP值与秋水仙碱、丹参酚酸B阳性对照组比较,无显著性差异(P>0.05)。  2.放射免疫法测定血清HA、P3NP、LN、CIV含量变化:肝纤维化四项检测结果证实在第11周末用药各组与模型对照组比较,血清HA、P3NP、LN、CIV值均下降,均有极显著性差异(P<0.01);其中白花丹醌低剂量组第11周,随着用药时间的延长,HA、P3NP、LN、CIV值逐渐降低,第11周末血清HA、P3NP、LN、CIV值与秋水仙碱、丹参酚酸B阳性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。  3.HE染色肝组织观察肝纤维化程度:空白对照组肝组织小叶结构完整,轮廓清楚,肝细胞条索排列整齐,肝窦清晰。汇管区小叶间动脉、静脉和小叶间胆管未见扩张、增生,也未见管腔狭窄、炎细胞浸润和纤维组织增生。模型对照肝组织肝出现纤维化,肝小叶结构不同程度破坏,肝小叶内及汇管区出现不同程度的纤维组织增生,少许炎细胞浸润,个别肝脏出现肝硬化,肝组织小叶结构破坏,原有肝小叶结构被纤维组织增生分割及包绕形成大小不等的圆形、椭圆形肝细胞团即形成假小叶。白花丹高剂量组肝细胞脂变(肝细胞脂肪变性):肝细胞胞质内出现脂滴,脂滴的大小不导致肝细胞外观大小不一,最终引起肝细胞排列紊乱。肝细胞广泛重度脂变,以中央 V为甚。白花丹醌中剂量组肝细胞大片中度脂变,以汇管区为主,肝细胞广泛轻-中度水肿。白花丹醌低剂量组肝细胞出现水肿,肝细胞胞质水份过多,体积增大,胞浆淡染色,透亮度增加。秋水仙碱组肝细胞广泛轻度水肿。丹参酚酸B组肝细胞出现轻中度中度片状脂变。  4. HE染色肝组织观察肝纤维化程度分期评分结果:与模型对照组比较各用药组均可降低大鼠的肝纤维化评分,积分比较均有极显著性差异(P<0.01);白花丹醌低剂量组与阳性对照组丹参酚酸B组比较,有显著性差异(P<0.05),与秋水仙碱组比较无显著性差异(P>0.05)。  第二部分白花丹醌干预肝纤维化大鼠模型后 HSEC超微结构特征的改变  电子显微镜进行 HSEC超微结构特征观察结果:空白对照组肝脏HSEC呈筛孔状结构,有大量大小不一的窗口,大窗孔直径约为1μm,小窗口约为0.1μm,皮下无基底膜;模型对照组HSEC窗口消失或大量减少,出现连续基底膜;白花丹醌高剂量组窦壁上窗口数量增多不明显,且窗口直径变大,基底膜减少不明显,内皮下基底膜成比连续状;白花丹醌中剂量窗口数量增多,窦壁成筛孔状,基底膜减少不明显;白花丹醌低剂量组窗口数量增多,窦壁成筛孔状与中剂量组比较窗孔更多,基底膜减少明显;秋水仙碱组和丹参酚酸B组窗口数量有少量增多,基底膜变化不明显;  第三部分白花丹醌干预肝纤维化大鼠模型后相关细胞因子mRNA含量的改变  1.凝胶电泳观察三种细胞因子CTGF、VEGF、END-1的mRNA在模型对照组的表达量均有明显升高,药物干预后三种细胞因子的mRNA表达量均有下降。  2.光密度分析结果,用药后各组细胞因子CTGF、VEGF、END-1的mRNA的表达量降低,与模型对照组比较均有极显著性差异(P<0.01),其中白花丹醌低剂量组CTGF、VEGF的mRNA表达含量与阳性对照组秋水仙碱和丹参酚酸比较,有显著性差异或极显著性差异(P<0.05或P<0.01),END-1的mRNA表达含量比较无显著性差异(P>0.05)。  结论:  1.白花丹醌低剂量组在保护肝功能,降低肝纤维化程度,逆转其病理变化,效果显著。  2.白花丹醌低剂量组在恢复HSEC窗孔数目,改变HSEC基底膜结构变化较其他给药组效果明显。对细胞因子CTGF、VEGF、END-1mRNA含量有抑制作用。  3.白花丹醌本身具有毒性,服用时间和剂量需要慎重,否则就会出现中毒症状(本实验白花丹醌高、中剂量组均在服用10周后出现中毒症状)。
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