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目的:证实AngⅡ可以诱导HL-1细胞Cx43下调。探讨Apelin-13对AngⅡ所诱导的HL-1细胞Cx43下调的影响;探讨Apelin-13对AngⅡ所诱导的HL-1细胞肥厚的影响;进一步探究Apelin-13调控AngⅡ诱导的HL-1细胞Cx43下调和自噬激活的机制。进一步探究Apelin-13对AngⅡ诱导的HL-1细胞肥厚的分子机制。方法:细胞培养和药物处理小鼠HL-1细胞加入到含有10%胎牛血清（加入1%双抗）的高糖培养基的培养瓶中,置于设定好的5%C02的37℃培养箱中培养。在显微镜下观察细胞贴壁生长密度约85%时,予以无血清高糖培养基饥饿处理24小时,并给与不同浓度的药物处理。所有药物试剂均现配现用。细胞活性实验HL-1细胞的活性由MTT试剂盒测量。HL-1细胞接种在96孔板中,给与不同的药物处理后,每孔加入5mg/ml MTT,96孔板于37℃孵箱中静置4小时,去掉上清液,只留下沉淀物,每孔加入150ul DMSO溶解沉淀,置于摇床上10min,在490nm波长下测量光密度值并计算细胞活性。细胞大小测量细胞在爬片上生长密度达到60%时,PBS洗3次后在装有爬片的24孔板中加入预先冷藏过的4%多聚甲醛,室温条件下静置10min。再用PBS静洗爬片3次,5min每次。室温下,在孔板中加入0.5%triton x-100干预5min。再次静洗爬片,孔板中加入FITC-鬼笔环肽,放置在37℃浮箱中孵育30min。静洗爬片,用滤纸吸干孔板水分,滴加DAPI后封片,约30s后在倒置荧光显微镜下观察。细胞免疫荧光接种HL-1爬片,分组经药物处理后,PBS漂洗后在装有爬片的24孔板中加入预先冷藏过的4%多聚甲醛,室温下固定15min,然后在3%BSA中封闭1h并用Cx43抗体在4℃孵育过夜。第二天漂洗后,加入荧光二抗（1:500）孵育爬片1h,再次PBS漂洗,滴加DAPI染料,封片,在倒置荧光显微镜下观察。Western blot 检测各组HL-1细胞用PBS漂洗后置于冰上,在培养瓶中加入RIPA裂解液,轻晃动培养瓶,用细胞刮刮取细胞悬液,于冰上裂解30min提取蛋白,采用BCA试剂盒检测各组蛋白的浓度。取约30-60ug蛋白上样量,接通电源跑胶2h,再半干转膜30-50min。后将PVDF膜置于装有5%脱脂奶粉抗体孵育盒中,室温摇床上封闭1-2h。抗体孵育盒中在摇床上用TBST漂洗3次,另加入稀释好的一抗（Cx43稀释浓度1:1000;AMPK 稀释浓度 1:1000;mTOR 稀释浓度 1:1000;BNP 稀释浓度 1:1000;LC3B稀释浓度1:1000;GAPDH稀释浓度1:5000）4℃摇床上孵育过夜。第二天再次用TBST漂洗PVDF膜5次弃去洗液,在孵育盒中加入HRP标记的二抗（1:5000）室温孵育1-2h,最后再漂洗5次,于暗室中配置发光液显影曝光。Image J软件进行条带灰度值测量。统计方法实验数据以means±SD表示,多组比较用One-way ANOVA 和Student-Newman-Keuls 检验。使用 SPSS 和 GraphPad Prism 6.0 软件进行统计分析和作图,P<0.05被认为具有统计学意义。结果:Apelin-13逆转AngⅡ所致的HL-1细胞Cx43下调分别用不同浓度的AngⅡ和Apelin-13处理HL-1细胞,发现在10uMAngⅡ单独处理时Cx43表达明显下降（p<0.05）,单独用Apelin-13处理对Cx43的表达没有影响,但是100nM Apelin-13和10uM AngⅡ同时处理48小时显示Apelin-13逆转AngⅡ所致的HL-1细胞Cx43表达的下调（P<0.05）。Apelin-13逆转AngⅡ所致的HL-1细胞AMPK活性的抑制分别单独用 AngⅡ 10uM 和 AngⅡ（10 μM）+Apelin-13（100 nM）处理细胞 15,30,60和120分钟后,western blot检测p-AMPK和AMPK的表达。AngⅡ单独处理可以降低p-AMPK/AMPK的比值并在60min最低（P<0.05）,但同时AngⅡ（10μM）和apelin-13（100 nM）处理细胞,与正常组相比,p-AMPK/AMPK的比值在30min时上升并随着时间延长保持稳定。CompoundC和Rapamycin抑制AMPK的表达和Apelin-13对AMPK的保护作用CompoundC作为AMPK的抑制剂抑制AMPK的表达,Rapamycin通过抑制mTOR作为常用的自噬激活剂。HL-1细胞处理后被分为5组:空白处理组,AngⅡ组,AngⅡ+Apelin-13组,AngⅡ+Apelin-13+CompoundC 组和 AngⅡ+Apelin-13+Rapamycin组。与空白处理组比较,AngⅡ组AMPK表达下降,而AngⅡ+Apelin-13组AMPK表达上升（P<0.05）。与 AngⅡ+Apelin-13组相比,AngⅡ+Apelin-13+CompoundC组和AngⅢ+Apelin-13+Rapamycin 组 AMPK 表达下降（P<0.05）。Apelin-13通过AMPK/mTOR通路促进自噬表达细胞分为5组处理后,分别测量自噬指标LC3和mTOR,与AngⅡ组相比,AngⅡ+Apelin-13 组 mTOR 表达下降,LC3Ⅱ 表达上升（P<0.05）。与 AngⅡ+Apelin-13组相比,AngⅡ+Apelin-13+Rapamycin 组 mTOR 表达下降,LC3Ⅱ 表达升高（P<0.05）,AngⅡ+Apelin-13+CompoundC 组 mTOR 表达上升,LC3Ⅱ 表达下降（P<0.05）。Apelin-13抑制AngⅡ所致的HL-1细胞增殖细胞在96孔板中培养,用不同浓度Apelin-13（10,100,1000 nM）单独或者联合AngⅡ（10μM）处理24小时,MTT结果表明Apelin-13单独处理对细胞存活率没有影响,但在l000nM的Apelin-13联合AngⅡ（10μM）可以明显增加细胞存活率（P<0.05）。Apelin-13通过AMPK/mTOR通路逆转AngⅡ所致的Cx43表达下调细胞免疫荧光和western blot实验结果显示,Apelin-13可以升高AngⅡ导致的HL-1细胞Cx43表达和分布下降。与AngⅡ+Apelin-13组相比,加入CompoundC（10uM）或者rapamycin（10nM）均能降低Cx43的表达和分布（P<0.05）,这表明AMPK/mTOR通路参与Apelin-13对Cx43的调节。Rapamycin逆转Apelin-13对BNP表达下降和细胞肥厚的保护作用Western blot实验检测各组细胞BNP蛋白的表达,细胞免疫荧光实验观察细胞骨架大小。AngⅡ可以升高BNP的水平和增加细胞肥大（p<0.05）,但Apelin-13预处理可以明显降低BNP的表达并减少细胞肥大（P<0.05）,而AngⅡ+Apelin-13+Rapamycin 组可以逆转 Apelin-13 的这种保护作用（P<0.05）,CompoundC对BNP表达和细胞肥大没有明显影响。结论:AngⅡ降低HL-1细胞Cx43的表达和分布、刺激自噬流和增加细胞肥大。但是,Apelin-13通过AMPK/mTOR通路逆转AngⅡ所致的HL-1细胞Cx43下调和细胞肥大并促进自噬,而自噬反过来抑制Cx43的表达和促进细胞肥大。因此,Apelin-13可能成为未来预防或者治疗AF的潜在药物。