研究目的:急性肝损伤(acute liver injury,ALI)是指突然出现大量肝细胞坏死或肝功能显著异常的综合征,以凝血机制障碍、黄疸及肝性脑病等症状为主要表现,可累及机体多个系统。该病起病急,病情危重,症状表现多样,肝细胞广泛坏死,且目前缺乏有效治疗手段,病死率较高。ALI致病病因主要有病毒感染、药物毒物反应、肝脏脂肪病变、自身免疫性疾病等。LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤是模拟人类急性肝损伤的常用模型,D-GalN的增敏作用能够有效增强LPS毒性,可在数小时内诱导小鼠产生急性肝损伤。在该模型中,肝脏枯否(Kupffer)细胞被激活,释放大量TNF-α、IL-1β及IL-6等炎症因子,继而诱导继发性肝损伤,是引起肝衰竭的主要原因。HMBOX1是人胰腺的cDNA文库中分离出来的新型转录抑制因子,在人类多种组织中都有表达,其中在胰腺、脑、肝脏、肾脏等组织中高表达,研究发现HMBOX1生物学功能涉及细胞分化、衰老、自噬与凋亡等多个领域。有文献报道,一种新型苯并恶嗪衍生物ABO会通过促进HMBOX1的表达,抑制抗分化分子IP10并促进促分化分子c-Ets-1(p54)的表达,从而促进骨髓来源基质细胞(BMSCs)向内皮细胞(ECs)分化;HMBOX1 也可通过 mTOR-4EBP1/p70S6K信号通路调节细胞自噬,并可促进端粒延长机制中APB小体的形成,以延长端粒寿命。我们实验室前期研究中发现,HMBOX1参与炎症调控机制。HMBOX1过表达后,NK细胞表达NKG2D及DAP10水平均明显下调,同时肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和穿孔素(perforin)的表达水平也有不同程度的下降。萤光素酶报告基因实验研究发现,HMBOX1可显著抑制IFN-γ启动子活性,进一步证实HMBOX1在NK细胞产生IFN-γ的过程中发挥重要抑制功能。HMBOX1在多种癌组织中都有不同程度的表达,在肝癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织,提示HMBOX1在肝癌的发生发展过程中可能发挥着重要的调控作用。炎症在肝癌发生过程中发挥重要作用,但HMBOX1与肝脏炎症相关性及作用机制还不明确。本研究中,我们通过构建HMBOX1肝细胞特异性基因敲除小鼠模型,并用LPS/D-GaIN诱导小鼠急性肝损伤,借以研究HMBOX1对肝脏炎症的调控机制。研究发现,肝细胞中HMBOX1特异性缺失可经HMBOXl/NF-κB/CCL2通路上调CCL2的表达,继而引起更多巨噬细胞向受损肝脏浸润,加重肝脏损伤;同时,肝细胞中HMBOX1的下降还可对其周边微环境中巨噬细胞的活化产生促进作用,增加细胞因子的释放,进一步加重肝脏损伤程度。研究方法:1.HMBOX1与肝细胞免疫应答1.1 HMBOX1与肝细胞代谢相关基因表达HepG2细胞中转染pEGFP-N1-HMBOXl过表达质粒,提取细胞总RNA,利用基因芯片技术对比分析受HMBOX1调控的基因。我们将HepG2细胞中转染HMBOXI过表达质粒,q-PCR法检测肝细胞代谢相关基因的变化,对基因芯片结果进行验证。1.2 HMBOX1与肝细胞炎症因子表达HepG2细胞中过表达HMBOX1,基因芯片技术对比分析HMBOX1可能参与的炎症调控通路;利用LPS/D-GaIN或LPS诱导肝细胞炎症模型,观察HMBOX1与肝细胞炎症之间的相关性。首先,LPS/D-GalN或LPS体外刺激BNL CL.2细胞系,q-PCR检测细胞内炎症因子及HMBOX1表达水平变化;体内实验中,小鼠腹腔注射LPS/D-GaIN诱导急性肝损伤模型,q-PCR和Western blot检测肝实质细胞中HMBOXI表达水平改变,观察HMBOX1与肝细胞炎症之间的相关性。1.3 HMBOX1与细胞自噬我们将HepG2细胞中转染HMBOXI过表达质粒,Western blot检测自噬相关指标LC3I1/LC3 I,并用免疫荧光法检测LC3B表达,以反映细胞自噬水平;同时采用Western blot法检测自噬通路中mTOR及其上游AKT、p38的活化程度,以分析该条通路是否受到HMBOX1表达水平升高的影响。2.HMBOX1与巨噬细胞免疫应答LPS刺激活化巨噬细胞RAW264.7,q-PCR检测细胞内炎症因子及HMBOX1表达水平变化;将RAW264.7细胞中过表达HMBOX1,流式细胞术检测细胞表面CD80、CD86水平的变化,ELISA法检测细胞培养上清中TNF-α和IL-6细胞因子水平,并用中性红吞噬实验研究HMBOX1过表达对巨噬细胞吞噬功能的影响,以综合评价HMBOX1对巨噬细胞活化及其功能的影响。3.HMBOX1肝细胞特异性基因敲除小鼠的建立与鉴定为研究HMBOX1对肝脏炎症的调控机制,我们采用Cre-loxp条件敲除法,将HMBOX1 floxed小鼠与Alb-cre鼠进行杂交,建立HMBOX1肝细胞特异性基因敲除小鼠模型,提取小鼠DNA进行基因型鉴定,并用Ⅳ型胶原原位消化法分离小鼠肝实质细胞,分别利用q-PCR和Western blot法对肝实质细胞中HMBOX1的表达水平进行检测,以评价HMBOX1的敲除程度;观察基因敲除小鼠与同窝对照小鼠的毛色特征、饮食习惯及活动能力,监测小鼠体重变化、肝组织表观,测定肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β等炎症相关细胞因子表达水平,并对原代肝实质细胞体外培养上清中ALT值进行检测,综合评价肝细胞特异性HMBOX1敲除对小鼠表观性状及肝脏功能的影响。4.HMBOX1对LPS/D-GalN诱导急性肝损伤的保护作用首先进行腹腔注射高剂量LPS造急性肝损伤模型,观察HMBOX1敲除对小鼠生存期的影响;再用腹腔注射LPS/D-GalN诱导急性肝损伤,观察小鼠肝组织表观,HE染色评价肝组织结构完整性,检测肝脏功能受损相关指标ALT,Western blot法检测caspase-3的活化,TUNEL法检测肝组织凋亡水平,多角度评价HMBOX1的保护作用;5.HMBOX1对LPS/D-GalN诱导急性肝损伤保护机制的研究5.1 HMBOX1对机体炎症水平的影响采用q-PCR法检测肝组织中炎症因子mRNA水平,并用ELISA法检测血清中炎症因子分泌水平,观察HMBOXI敲除对机体炎症水平的影响,再采用Western blot检测方法对肝组织中NF-1κB及MAPK信号通路中关键因子及其活化水平进行检测,进一步证实HMBOX1与肝脏炎症的相关性及参与调控的炎症相关信号通路。5.2肝细胞中HMBOX1通过NF-κB/CCL2通路抑制巨噬细胞向受损肝脏的浸润采用流式细胞分析的方法对肝组织中免疫细胞的浸润程度进行分析,观察FMBOX1敲除对CDIlb+Gr-ldimF4/80+巨噬细胞的浸润程度的影响;ELISA法对肝组织匀浆上清中单核巨噬细胞相关趋化因子CCL2、CCL4及CCL5水平进行检测,观察相关趋化因子在HMBOXI敲除小鼠肝组织中表达程度的改变。为证实HMBOX1对CCL2的调控作用,我们在Hepal-6细胞中转染HMBOX1过表达质粒,q-PCR法确证转染效果,同时对CCL2的mRNA水平进行了检测,评价HMBOX1的上调对CCL2表达水平的影响;我们参考文献,用Western blot结果验证HMBOX1是否可抑制NF-κB的表达及活化,并用萤光素酶报告基因实验(luciferase report assay)证实HMBOX1对NF-1κB的调控作用。接着,我们用transwell实验以期证实Hepal-6细胞过表达HMBOX1对巨噬细胞迁移能力的影响。为进一步确证CCL2的关键作用,我们采用尾静脉注射CCL2中和抗体的方式阻断急性肝损伤小鼠体内的CCL2,流式细胞分析方法检测肝组织中CDIl1b+Gr-ldimF4/80+单核巨噬细胞浸润程度,并对外周血ALT水平进行测定,评价CCL2在HMBOXI调节功能发挥过程中的作用。5.3肝细胞中HMBOX1可抑制与之共孵育巨噬细胞的活化我们将Hepal-6细胞中转染HMBOX1过表达质粒48h后,加入巨噬细胞RAW264.7或原代腹腔巨噬细胞,在静息状态下或LPS刺激条件下进行巨噬细胞与肝细胞的共孵育,ELISA法检测细胞培养上清中TNF-a和IL-6的分泌水平,评价Hepal-6细胞中HMBOX1过表达对共孵育巨噬细胞炎症因子表达水平的影响,同时我们又采用流式细胞分析法检测巨噬细胞活化标志物MHCII及CD80的表达水平,进一步评价HMBOX1对巨噬细胞活化水平的影响。5.4 HMBOX1过表达进一步确证上述结论为进一步证实HMBOX1在急性肝损伤病变过程中的保护作用,我们采用尾静脉高压注射HMBOX1过表达质粒的方法促进HMBOX1敲除小鼠肝细胞中HMBOX1表达水平的恢复,2日后再行腹腔注射LPS/D-GalN刺激,分离小鼠肝脏组织观察充血程度,利用流式细胞分析方法检测肝组织中CD11b+Gr-1dimF4/80+巨噬细胞浸润程度,并对外周血中ALT水平进行检测,验证肝细胞中HMBOX1升高对巨噬细胞浸润及肝脏功能的影响。研究结果1.HMBOX1与肝细胞免疫应答1.1 HMBOX1与肝细胞代谢相关基因表达基因芯片技术对比分析发现,HepG2细胞过表达HMBOX1后,肝细胞中代谢相关基因APOA1BP、CYP2W1、CYP46A1、CYP26B1及HPD的表达水平都有不同程度的升高。q-PCR法检测结果也显示,HepG2细胞中HMBOX1高表达后,上述肝细胞代谢相关基因表达水平升高,而在HMBOX1沉默后皆有明显下调。1.2 HMBOX1与肝细胞炎症因子表达LPS/D-GalN或LPS刺激肝细胞BNL CL.2细胞后,q-PCR结果显示细胞中HMBOX1水平显著下调;体内LPS/D-GalN诱导急性肝损伤模型,小鼠肝实质细胞中HMBOX1水平明显下降,提示HMBOX1与肝细胞炎症间具有负向相关性。1.3 HMBOX1与细胞自噬HepG2细胞中过表达HMBOX1后,细胞自噬相关指标LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值显著上调,免疫荧光法检测LC3B表达水平升高,表明HMBOX1可显著促进细胞自噬水平的增加;Western blot法检测结果显示,自噬通路中mTOR及其上游AKT、p38的磷酸化水平明显减弱,表明其活化程度降低。2.HMBOX1与巨噬细胞免疫应答巨噬细胞系RAW264.7细胞经LPS诱导活化后,细胞中HMBOXI水平显著下降。当RAW264.7细胞中HMIB0X1过表达后,LPS诱导的细胞活化过程受到抑制,表现为细胞表面CD80、CD86表达水平下降,细胞分泌TNF-а和IL-6水平降低,并且RAW264.7细胞的吞噬功能也明显受到抑制,表明HMBOX1对巨噬细胞的活化程度具有负调作用。3.HMBOX1肝细胞特异性基因敲除小鼠模型的构建对HMBOXI floxed鼠与Alb-cre鼠杂交后代,DNA检测结果符合HMBOX1f/f且Alb-cre+小鼠即为敲除小鼠(Hm△hep),同窝Alb-cre-小鼠为对照小鼠(Hmf/f);对HmAhep小鼠肝实质细胞中HMBOXI进行检测,mRNA水平及蛋白水平都证实HMBOXI水平明显下降,表明HMBOX1肝细胞特异性基因敲除小鼠模型构建成功。与Hmf/f鼠相比,Hm△hep小鼠毛色特征、饮食习惯、活动能力及小鼠体重变化、肝组织表观等方面无明显差别,肝组织中TNF-а、IL-1β、IL-6和TGF-β等炎症相关细胞因子表达水平也与对照组无显著性差异,原代肝实质细胞体外培养结果也未发现肝损伤的明显增加,表明HMBOX1肝细胞特异性敲除不会影响小鼠生长状态。4.HMBOX1对LPS/D-GalN诱导急性肝损伤衰竭的保护作用腹腔注射LPS/D-GalN刺激小鼠,与Hmf/f相比,Hm△hep小鼠肝脏充血严重程度明显增加,肝脏/体重比升高,HE染色发现肝组织完整性破坏程度更为严重,肝细胞凋亡因子caspase3活化水平增加,TUNEL检测结果也显示Hm△f/f△hep小鼠肝脏凋亡水平增加;此外,Hm△hep小鼠外周血中ALT值也明显偏高。这些结果表明HMBOX1的敲除加重了 LPS/D-GaIN诱导的肝脏损伤。5.HMBOX1对LPS/D-GaIN诱导急性肝损伤衰竭保护机制的研究5.1 HMBOX1对机体炎症水平的影响首先,小鼠腹腔注射LPS刺激后,与Hmf/f相比,Hnm△hep小鼠肝组织中TNF-а、IL-1β、IL-6、IL-17及iNOS等炎症因子表达水平明显增高,外周血中TNF-а分泌水平也明显高于对照小鼠;LPS/D-GalN联合刺激后,HmAhep小鼠外周血中TNF-α、IL-6分泌水平明显高于Hmf/f小鼠。Western blot检测结果也显示,Hm△hep小鼠肝组织中NF-κB、ERK1/2、JNK及其下游c-Jun的活化水平明显升高,表明肝细胞特异性HMBOX1的敲除促进了肝组织中NF-κB和MAPK信号通路的活化,并促进了机体炎症水平的升高。5.2肝细胞中HMBOXI抑制NF-κB/CCL2途径减少巨噬细胞向肝脏内的浸润LPS/D-GalN联合刺激后,HmAhep小鼠肝脏非实质细胞中CDllb+Gr-ldimF4/80+巨噬细胞比例及数量明显升高,表明CDllb+Gr-ldimF4/80+巨噬细胞浸润程度增加;在对小鼠肝组织匀浆的ELISA检测结果中发现,Hm△hep小鼠肝组织中CCL2水平明显高于对照小鼠,但CCL4及CCL5与对照小鼠相比无显著差异。体外实验结果显示,Hepal-6细胞中HMBOX1过表达可明显抑制CCL2的表达;同时,Western blot检测发现NF-κκB磷酸化水平有所下调,luciferase report assay结果也证实HMBOX1的升高可抑制NF-κB的活化。Transwell实验结果显示,Hepal-6细胞中HMBOX1过表达可抑制与之共孵育巨噬细胞的迁移能力,CCL2抗体中和后,小鼠肝组织中CDllb+Gr-ldimF4/80+巨噬细胞浸润程度明显减弱,外周血中ALT水平下降,此结果进一步证实了 HMBOX1经抑制巨噬细胞浸润而减少肝组织损伤的保护机制。5.3肝细胞中HMBOX1可抑制与之共孵育巨噬细胞的活化过表达HMBOX1的Hepal-6细胞与RAW264.7细胞/腹腔巨噬细胞在静息状态或LPS刺激条件下共孵育,细胞上清中TNF-а及IL-6分泌水平明显低于对照组;在与HMBOX1过表达的Hepal-6细胞共孵育后,腹腔巨噬细胞上MHCII和CD80的表达水平也明显下调,表明肝细胞中HMBOXI可抑制与之共孵育巨噬细胞的活化及炎症因子的释放。5.4 HMBOX1过表达进一步确证上述结论对Hm△hep小鼠行尾静脉高压注射HMBOX1过表达质粒,2日后进行腹腔注射LPS/D-GalN刺激,实验结果显示HMBOX1过表达小鼠肝脏组织充血程度明显减轻,流式细胞分析检测发现肝组织中CD11b+Gr-1dimF4/80+巨噬细胞浸润数量明显减少;同时,外周血中ALT水平也发生了明显下降,进一步证实了 HMBOX1在该模型中的保护作用。研究结论1.HMBOX1具有抑制肝细胞炎症应答的作用;2.HMBOX1具有抑制巨噬细胞活化及吞噬功能;3.HMBOX1可通过促进细胞自噬水平抑制肝细胞炎症;4.HMBOX1可通过抑制NF-κB/CCL2通路降低CCL2的表达,继而抑制CD11b+Gr-1dimF4/80+巨噬细胞在肝组织中的聚集,对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤发挥保护作用;5.肝细胞中HMBOX1可抑制肝脏微环境中巨噬细胞的活化,进一步降低LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤。研究意义本研究发现,肝细胞中表达的HMBOX1对LPS/D-GalN诱导急性肝损伤的保护作用,并证明HMBOX1可负调NF-κB/MAPK信号通路,抑制炎症因子的表达,并降低CCL2的表达而抑制CD11b+Gr-1dimF4/80+巨噬细胞在肝脏组织的聚集;同时,肝细胞中HMBOX1还可抑制微环境中巨噬细胞的活化。此外,肝细胞中HMBOX1还可促进细胞自噬水平,继而抑制肝脏炎症并维护肝脏内环境的稳态。HMBOX1对急性肝损伤的保护作用为该病症的临床治疗探索新的策略与思路。