研究背景尽管发达国家子宫颈癌的发病率明显下降，但发展中国家下降趋势却不明显，仍是威肋妇女身体健康的主要恶性肿瘤之一。其生物学行为主要是淋巴转移和直接蔓延，即使非常早期的子宫颈癌也可发生淋巴转移。淋巴转移不仅是其独立的预后因素，而且还是制定其治疗方案的主要参考依据，而治疗前盆腔淋巴转移状态的评估目前尚无理想的手段，这已成为妇科肿瘤工作者的重要课题之一。综合文献报道与早期子宫颈癌盆腔淋巴转移相关的临床病理因素有临床分期、肿块大小、血清鳞状细胞癌抗原水平、组织学类型、肿瘤细胞分化、间质浸润深度和脉管癌栓等，但各家文献报道结果尚不统一，而且部分高危因素术前难于得到，故根据临床病理特征来预测子宫颈癌患者淋巴转移状态尚有困难。前哨淋巴结(sentinel lymph node，SLN)活检术(sentinel lymph node biopsy，SLNB)可以预测早期子宫颈癌患者的盆腔淋巴结受侵状态，显示了较好的临床应用前景。但由于研究时间短、对研究病例仍需长期随诊，存在假阴性和需要良好的检测方法、高水平的手术和病理检查技术等限制了其临床的进一步推广应用。迄今为止，治疗前淋巴转移的预测主要手段目前仍是影像学检查。由于CT和MRI只能检测直径1cm以上的淋巴结，且难于区别淋巴结转移灶和坏死灶及疤痕，因此其敏感性较差。正电子发射断层成像(positron emission tomography，PET)采用18—氟脱氧葡萄糖(fluorine-18-fluoro-2-deoxy-D-glucose，FDG)作为示踪剂，已广泛应用于妇科恶性肿瘤的成像，尽管多数研究显示FDG-PET判断子宫颈癌后腹膜淋巴转移的敏感性和特异性均明显高于CT和MRI，但其仍可漏诊盆腔微小转移性淋巴病灶，同时部分患者的治疗因FDG-PET的结果而受到影响。肿瘤转移是癌基因和抑癌基因等多种基因参与调节的一个多步骤、多因素的极其复杂的过程，通过肿瘤转移相关基因的过度表达以及一系列基因产物的参与，对肿瘤转移整个过程进行调控。基因芯片技术可同时对大量基因的表达、突变和多态性进行快速、准确的检测，从而达到高效筛选差异表达基因的目的。基因芯片技术为研究肿瘤发生、发展中的基因开关及表达程度提供了强有力的工具。利用它，可随时获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式。基因芯片技术在肿瘤研究领域中具有非常重要的价值，可为肿瘤的分子病理诊断、临床肿瘤预后的判断及治疗方案的选择提供了理论指导。2001年Hippo首次利用不同转移潜能的胃癌细胞系，分析全基因表达，显示其中的差异，发现12个基因表达上调，20个基因表达下调，为肿瘤转移研究开辟了新的途径。随后陆续报道了利用基因芯片技术分析伴与不伴淋巴结转移胆管癌、肝癌、口腔癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌等多种组织差异表达基因的研究。我国香港和新疆学者等利用基因芯片技术对子宫颈癌组织中差异表达基因与其发生发展进行了研究。有关利用基因芯片技术筛选子宫颈癌淋巴转移相关基因的文献报道只有一篇，挪威学者Lyng利用基因芯片技术筛选了子宫颈癌淋巴转移相关基因，共筛选出31条差异表达基因，但其研究对象包括了晚期的子宫颈癌。本研究首先拟通过对手术治疗的ⅠB～ⅡA期子宫颈鳞癌患者的临床病理特征、治疗前血清SCC-Ag水平和相关出凝血检验指标与盆腔淋巴转移的关系进行单因素和多因素分析，旨在探索早期子宫颈鳞癌盆腔淋巴转移的临床高危因素。然后拟利用基因芯片技术，以临床切除的早期子宫颈鳞癌标本为研究对象，筛选早期子宫颈鳞癌盆腔淋巴转移相关基因，对表达差异的基因进行生物信息学分析；同时利用实时荧光定量RT-PCR及western blot技术检测了30例早期子宫颈鳞癌组织中部分筛选出的、与盆腔淋巴转移相关的基因mRNA和蛋白的表达，进一步明确这些基因与早期子宫颈鳞癌盆腔淋巴转移的关系。为进一步探索正确预测早期子宫颈鳞癌盆腔淋巴转移状态的肿瘤分子标志物奠定实验依据。第一部分早期子宫颈鳞癌盆腔淋巴转移相关因素的临床分析研究目的：探讨早期子宫颈鳞癌盆腔淋巴转移的临床高危因素。材料与方法：回顾性分析了2004年2月～2007年1月在浙江大学医学院附属妇产科医院治疗、资料完整的135例ⅠB～ⅡA子宫颈鳞癌患者的临床病理资料和术前3天内血清鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag)水平、血浆纤维蛋白原水平、血小板数量和血红蛋白水平，选择10个非重复的特征性因素，包括患者年龄、临床期别、肿瘤直径、病理分化程度、深肌层浸润、脉管瘤栓、治疗前血清SCC-Ag水平，以及治疗前血小板数量、血浆纤维蛋白原和血红蛋白水平与盆腔淋巴转移关系进行单因素和多因素分析。结果：135例ⅠB～ⅡA子宫颈鳞癌患者术后病理证实共切除盆腔淋巴结3996枚，平均每例29.6枚，范围20～47枚。病理证实盆腔淋巴结存在癌灶浸润17例，淋巴转移率为12.6％(17／135)。单因素分析结果显示子宫颈肿块大小、血小板数量、纤维蛋白原水平、肿瘤浸润深度和脉管浸润与盆腔淋巴转移有关(P＜0.05)，其危险性分别是2.701、1.011、3.574、3.165和3.930倍。多因素分析结果显示血浆纤维蛋白原水平和肿瘤脉管浸润是ⅠB～ⅡA期子宫颈鳞癌患者盆腔淋巴转移独立的相关因素，其危险性分别是3.674和4.568倍。结论：癌组织中脉管癌栓阳性和手术前血浆纤维蛋白原水平是早期子宫颈鳞癌患者盆腔淋巴转移的独立相关因素。第二部分早期子宫颈鳞癌盆腔淋巴转移相关基因表达谱分析研究目的：利用基因芯片技术分析伴与不伴盆腔淋巴转移早期子宫颈鳞癌组织中差异表达基因。材料与方法：应用包含代表人类全基因组47，000个转录本、代表了38，500个明晰的人类基因的Affymetrix U133 plus 2.0基因表达谱芯片，对4例ⅠB1期子宫颈鳞癌和2例正常子宫颈组织进行基因表达谱分析，比较组织间差异表达基因。结果：杂交后扫描图像阳性对照点信号强，阴性对照点与空白对照点信号弱或无。图像信号清晰，背景信噪低。有盆腔淋巴转移和无转移早期子宫颈鳞癌组织中，2倍以上差异基因322条，其中在有盆腔淋巴转移组织中，表达上调的基因有182条，表达下调的基因140条。4倍以上差异基因23条，其中在有盆腔淋巴转移组织中上调基因14条，下调基因9条。正常子宫颈组织与无盆腔淋巴结转移早期子宫颈鳞癌组织中基因表达无差异，但在有盆腔淋巴转移和无淋巴转移宫颈鳞癌组织中2倍以上差异基因有33条。其中在有淋巴转移组中，上调基因17条，下调基因16条。与正常子宫颈组织相比，无盆腔淋巴结转移早期子宫颈鳞癌组织中表达上调的基因，在有盆腔淋巴转移宫颈鳞癌组织中表达下调基因8条。与正常子宫颈组织相比，无盆腔淋巴结转移早期子宫颈鳞癌组织中表达下调的基因，在有盆腔淋巴转移宫颈鳞癌组织中表达上调基因6条。与正常子宫颈组织相比，无盆腔淋巴结转移早期子宫颈鳞癌组织中表达上调的基因，在有盆腔淋巴转移宫颈鳞癌组织中未发现进一步表达上调基因。与正常子宫颈组织相比，无盆腔淋巴结转移早期子宫颈鳞癌组织中表达下调的基因，在有盆腔淋巴转移宫颈鳞癌组织中未发现进一步表达下调基因。结论：早期子宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移是多基因作用的综合结果，基因芯片技术是一项可用于筛选预测盆腔淋巴转移相关基因的有效方法。第三部分早期子宫颈鳞癌中VSNL1、VCAM1、autotaxin、septin 11的表达及与盆腔淋巴转移的关系研究目的：检验经基因芯片筛选出的部分基因与早期子宫颈鳞癌盆腔淋巴转移的关系。材料和方法：选择经基因芯片筛选出的4个表达差异基因VCAM1、VSNL、autotaxin、septin 11，采用实时荧光定量RT-PCR及western blot验证其在正常子宫颈组织、无转移和转移早期子宫颈鳞癌组织中的表达差异。结果：VCAM1实时荧光PCR检测mRNA相对表达量：正常子宫颈组织0.087，无转移早期子宫颈鳞癌组织30.473，有转移早期子宫颈鳞癌组织828.259，和子宫颈正常组织相比，早期子宫颈鳞癌组织中VCAM1的mRNA表达上调(P＜0.05)，在有无盆腔淋巴转移的组织中表达进一步上调(P＜0.05)。VSNL实时荧光PCR检测mRNA相对表达量：正常子宫颈组织0.032，无转移早期子宫颈鳞癌组织69.363，有转移早期子宫颈鳞癌组织731.472，和子宫颈正常组织相比，早期子宫颈鳞癌组织中VSNL的mRNA表达上调(P＜0.05)，但在有无盆腔淋巴转移的组织中表达无显著性差异。autotaxin实时荧光PCR检测mRNA相对表达量：正常子宫颈组织2034.187，无转移早期子宫颈鳞癌组织36.944，有转移早期子宫颈鳞癌组织0.408，和子宫颈正常组织相比，早期子宫颈鳞癌中autotaxin的mRNA表达下调(P＜0.05)，在有淋巴转移的组织中表达进一步下调(P＜0.05)。septin 11实时荧光PCR检测mRNA相对表达量：正常子宫颈组织1264.31，无转移早期子宫颈鳞癌组织53.970，有转移早期子宫颈鳞癌组织0.058，和子宫颈正常组织相比，早期子宫颈鳞癌中septin11的mRNA表达下调(P＜0.05)，在有淋巴转移的组织中表达进一步下调(P＜0.05)。和正常子宫颈组织相比，早期子宫颈鳞癌组织中VCAM1蛋白表达上调(相对表达量分别为0.414和0.262，P＜0.05)，而在有淋巴结转移的组织中表达进一步上调(相对表达量分别为0.907和0.414，P＜0.05)。和正常子宫颈组织相比，早期子宫颈鳞癌中VSNL蛋白表达上调(相对表达量分别为0.436和0.253，P＜0.05)，而在有淋巴转移的组织中表达上调无显著性差异。和正常子宫颈组织相比，早期子宫颈鳞癌中septin 11蛋白表达下调(相对表达量分别为0.509和0.780，P＜0.05)，而在有淋巴转移的组织中表达下调无显著性差异。结论：1．VCAM1在有淋巴结转移的早期子宫颈鳞癌组织中表达显著上调，提示VCAM1在促进早期子宫颈鳞癌发生盆腔淋巴转移的过程中起着重要作2．VSNL1、autotaxin和septin 11在有淋巴结转移的早期子宫颈鳞癌中的表达水平不同于其他肿瘤，提示这些基因在早期宫颈癌发生淋巴转移过程中的作用尚有待于进一步研究。