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背景:乳腺癌（Breast cancer,BC）是全球女性最高发病率的恶性肿瘤,全球女性乳腺癌发病率正在逐年升高,是全世界第一大肿瘤,女性健康正经受着重大威胁。目前临床上,根据乳腺癌典型分子受体:雌激素受体（Estrogen receptor,ER）、孕激素受体（Progesterone receptor,PR）、人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2,HER2）的表达而制定患者的治疗方案,也并不适用于所有的乳腺癌患者。HER2+乳腺癌恶性程度较高,早期易复发和转移,总体预后较差。传统的肿瘤细胞培养以及人源性肿瘤异种移植模型（Patient-derivedxenografts,PDX）为乳腺癌的基础研究,提供了大量材料,然而,由于许多实验室实验技术的缺陷以及PDX培养周期长,难以满足乳腺癌深入研究的需要。因此,研究人员迫切需要建立一个能够真实、准确地模拟人类肿瘤特征的实验模型。肿瘤类器官是取用患者体内原发性肿瘤组织,在实验室培养出的微型肿瘤3D模型,与传统的肿瘤细胞系和PDX模型相比,类器官具有拟合度高、培养周期短、传代稳定等优点,近年来在肿瘤研究中得到了广泛应用,并取得了一定的进展。目前,世界各地的实验室已陆续培养出肝脏、胰腺、肺、肾、视网膜等具有显微结构的类器官组织。过继性免疫疗法（Adoptive cell therapy,ACT）是今年来引起广大科研工作者的新兴肿瘤免疫疗法。该疗法从肿瘤患者或者健康人志愿者（Healthy donor,HD）体内分离出肿瘤抗原特异性T细胞（Tumor-antigen specific T cell）,在体外进行基因改造后扩增或者直接扩增后再回输回患者体内,其对于难治性及转移性肿瘤患者的治疗有着较好的疗效。ACT疗法分为肿瘤浸润淋巴细胞疗法（Tumor infiltration lymphocyte,TIL）,T细胞受体基因修饰T细胞疗法（T cell receptor-engineered T cells,TCR-T）,嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric antigen receptor,CAR-T）等。近些年,CAR-T细胞免疫疗法在恶性血液肿瘤,例:B系急性淋巴细胞白血病（B-lineage acute lymphoblastic leukemia）的治疗上取得了鼓舞人心的成功,这种显著的疗效不仅导致了B细胞恶性肿瘤治疗模式发生明显的转变,而且也有力地推动了CAR-T细胞疗法在实体肿瘤中的应用。目前乳腺癌类器官（Breast cancer organoid,BCO）研究在国内尚处于起步阶段,且国外也缺乏利用CAR-T细胞对类器官模型进行功能验证的相关研究,鉴于此,我们拟通过构建HER2+乳腺癌类器官模型,并利用该模型来验证HER2 CAR-T细胞的特异性杀伤功能,并建立一套CAR-T细胞体外功能验证的通用方法学,为CAR-T细胞免疫疗法的临床转化奠定基础。目的:1.构建HER2+乳腺癌类器官模型。2.制备HER2 CAR-T细胞,并利用HER2+乳腺癌模型进行特异性杀伤功能检测。3.基于上述模型初步建立一套适用于CAR-T细胞体外功能验证的通用方法,为CAR-T细胞免疫疗法的临床转化奠定基础。方法:1.收集HER2+乳腺癌患者的肿瘤组织,构建乳腺癌类器官模型,镜下观察类器官生长状况并进行细胞计数。2.将培养的乳腺癌类器官和其来源肿瘤组织经石蜡包埋、切片,并分别进行H＆E和ER、PR、HER2的免疫组化染色。3.利用基因工程技术,将HER2-CAR序列克隆进慢病毒表达载体p WPXL,构建含有CD8α铰链区、CD28跨膜区、CD137（4-1BB）和CD3ζ共刺激结构域的sc Fv的二代CAR质粒,并利用三质粒慢病毒转染系统,制备HER2 CAR慢病毒。4.,采用密度梯度离心法将收集的健康人志愿者静脉血分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,并添加Dynabeads活化,培养过程中分别IL-15+IL-21或者IL-2培养T细胞。5.制备HER2 CAR-T细胞:将HER2 CAR慢病毒感染PBMC,5天后流式细胞术检测HER2 CAR阳性率,10天后对HER2 CAR-T细胞进行非特异性快速扩增。6.HER2 CAR-T细胞杀伤性功能检测:分别以HER2+乳腺癌细胞系SK-BR-3和乳腺癌类器官作为靶细胞,采用RTCA系统实时监测细胞的存活信号、采用钙黄绿素染色法进行HER2 CAR-T细胞特异性杀伤功能检测。结果:1.成功构建乳腺癌类器官模型,并通过形态学、分子水平（ER、PR以及HER2）和基因表达水平证实该类器官模型高度保留了原代肿瘤组织的遗传基因特性,为后续HER2 CAR-T功能检测奠定基础。2.IL-15/21联合ploybrene处理经Dynabeads活化后的PBMC,能够有效提升HER2 CAR慢病毒对PBMC的感染效率达50%。3.HER2 CAR-T细胞能够特异性杀伤HER2+乳腺癌细胞系和乳腺癌类器官,且效靶比在1:1～10:1间均存在统计学差异（P＜0.05）,其中在效靶比为10:1时,对乳腺癌类器官杀伤率高达40%。结论:1.成功构建出能够真实反映HER2+乳腺癌患者肿瘤特征的类器官模型。2.制备的HER2 CAR-T细胞可特异性杀伤HER2+的乳腺癌细胞系SK-BR-3及构建的HER2+乳腺癌类器官。3.通过构建能够表达肿瘤抗原的类器官模型,再制备针对该肿瘤抗原的CAR-T细胞,初步建立一套适用于CAR-T细胞体外功能验证的通用方法,为CAR-T细胞免疫疗法的临床转化奠定基础。