细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是革兰氏阴性细菌的主要毒性成分。已有研究表明,多种妊娠不良结局常和孕期LPS暴露相关,孕晚期母体LPS暴露可以导致胎儿宫内受限（intrauterine growth restriction,IUGR）。IUGR是指胎儿未能达到其遗传决定的生长潜能,临床上指出生体重低于同孕龄同性别平均出生体重第10个百分位数或两个标准差。IUGR不仅是造成围产期胎儿高发病率和死亡率的主要原因,而且也增加了多种成年期慢性疾病的发生风险。目前,IUGR在中国以及全世界范围内发生率一直居高不下,但是LPS暴露是如何导致胎儿生长受限的机制仍不清楚。研究发现,孕期母体糖皮质激素（glucocorticoid,GC）的过量暴露不仅可以导致IUGR,而且导致了成年后多种慢性病的发生。在动物体内,皮质酮是其中最重要的糖皮质激素;而在人类中,糖皮质激素以皮质醇为主。GC在维持正常妊娠中发挥着重要的作用,同时对于胎儿的正常发育和分娩也是极其重要的。因此,控制胎儿循环中合适的GC水平对于营造安全的宫内发育环境是必不可少的。Ⅱ型11β-羟基固醇脱氢酶（11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,11β-HSD2）是一类最重要的胎盘糖皮质激素屏障,在胎盘绒毛的合胞体滋养层细胞中高表达,能够将有生物学活性的GC代谢为无生物学活性的形式,阻止母体过多的GC通过胎盘屏障进入到胎儿体内。孕期LPS暴露可以下调胎盘11β-HSD2表达,胎盘11β-HSD2的缺失干扰了胎盘的屏障功能,母体过多的GC透过胎盘屏障进入到胎儿体内,引起了IUGR。这些研究结果提示,孕期LPS暴露可能通过抑制胎盘11β-HSD2,损伤胎盘屏障功能进而引起IUGR,但是LPS是如何下调胎盘11β-HSD2及其机制目前还不明确。1.LPS暴露对小鼠胎盘和人胎盘滋养细胞11β-HSD2表达的影响。ICR孕鼠随机分为5组,Control组,LPS 2 h组,LPS 6 h组,LPS 12 h组,LPS 24 h组。在孕第16天（gestational day 16,GD 16）母鼠单次腹腔（intraperitoneal,i.p.）注射LPS（200μg/kg）或生理盐水（normal saline,NS）,在LPS暴露后0 h,2 h,6 h,12 h,24 h处死小鼠,留取胎盘组织,检测胎盘11β-HSD2蛋白表达和mRNA水平。结果发现:LPS暴露后,从2 h开始,胎盘11β-Hsd2 mRNA水平开始下降,一直持续到6 h。胎盘11β-HSD2蛋白表达在LPS暴露后12 h开始明显下降,到24 h仍持续下降。将HTR-8/SVeno细胞分为5组:Control组,LPS 2 h组,LPS 6 h组,LPS 12h组,LPS 24 h组。待细胞长到70%左右,HTR-8/SVeno细胞给予LPS（2μg/mL）或PBS（phosphate buffer saline,磷酸缓冲盐溶液）共培养。在LPS暴露后0 h,2 h,6h,12 h,24 h收集细胞,检测人胎盘滋养细胞中11β-HSD2蛋白表达和mRNA水平。结果显示:11β-HSD2 mRNA从LPS暴露后2 h开始下降,一直持续下降到24 h;人胎盘滋养细胞中11β-HSD2蛋白表达在LPS暴露后6 h开始降低,一直降低持续到24 h。以上研究结果提示LPS暴露抑制了小鼠胎盘和人胎盘滋养细胞中11β-HSD2的表达。2.PPARγ激动剂对人胎盘滋养细胞11β-HSD2的影响将HTR-8/SVeno细胞分为Control组,RSG（Rosiglitazone,罗格列酮）10^-77 M组,RSG 10^-66 M组。HTR-8/SVeno细胞和不同浓度RSG共培养24 h后收集细胞,检测HTR-8/SVeno细胞中PPARγ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,过氧化物酶体增殖物激活受体）和11β-HSD2蛋白水平。结果发现:不同浓度RSG共培养后,人胎盘滋养细胞中PPARγ和11β-HSD2的蛋白表达是逐渐升高的,而且均呈剂量效应关系。将HTR-8/SVeno细胞分为Control组,RSG组,RSG+GW9662组(GW9662浓度为10^-3 M),RSG+GW9662组(GW9662浓度为10^-2 M)。首先将HTR-8/SVeno细胞与不同浓度GW9662（2-Chloro-5-nitro-N-phenylbenzamide,PPARγ抑制剂）共培养24 h后,继续添加10^-6 M RSG共培养24 h,然后检测HTR-8/SVeno细胞中PPARγ和11β-HSD2蛋白水平。结果显示:RSG预处理上调了HTR8/SVeno细胞中PPARγ核蛋白的表达水平,然而GW9662暴露后减弱了RSG上调人胎盘滋养细胞中PPARγ核蛋白表达;相应的,GW9662暴露抑制RSG诱导人胎盘滋养细胞中11β-HSD2蛋白表达,均呈剂量效应关系。这些研究结果表明:RSG上调了人胎盘滋养细胞中11β-HSD2的表达,PPARγ抑制剂可以拮抗RSG上调人胎盘滋养细胞11β-HSD2的表达,提示胎盘11β-HSD2可能是PPARγ直接的下游作用靶蛋白。3.LPS暴露对小鼠胎盘PPARγ及其靶基因的影响ICR孕鼠从GD16开始,腹腔注射LPS（200μg/kg）或NS,分别在LPS注射后0 h,2 h,6 h,12 h,24 h处死小鼠,留取胎盘组织,检测胎盘PPARγ核转位以及PPARγ靶基因水平。结果表明:从LPS暴露后2 h开始,一直持续到24 h,LPS暴露明显抑制了小鼠胎盘PPARγ核转位;胎盘PPARγ靶基因Vegf和Cd36 mRNA明显被抑制。将ICR孕鼠随机分为Control组,RSG组,LPS组以及LPS+RSG组。从GD14至GD16,孕鼠每天灌胃补充RSG（10 mg/kg）或NS;在GD16,灌胃RSG 1 h后,孕鼠腹腔注射LPS（200μg/kg）或NS,在LPS暴露后12 h统一取材,留取胎盘组织,检测胎盘PPARγ核转位以及在胎盘细胞定位情况,同时检测了PPARγ靶基因mRNAs水平。研究结果发现:RSG预处理促进小鼠胎盘PPARγ核转位,在小鼠胎盘迷路层滋养细胞中观察到明显的PPARγ阳性细胞核;LPS暴露抑制RSG激活小鼠胎盘PPARγ核转位,胎盘迷路层滋养细胞上PPARγ阳性细胞核数明显减少;RSG预处理上调小鼠胎盘Cd36 mRNA水平,而LPS暴露后,明显抑制RSG上调Cd36 mRNA水平;然而RSG预处理对小鼠胎盘Vegf mRNA水平无明显影响。结果表明:LPS暴露后抑制了小鼠胎盘PPARγ。4.LPS暴露对人胎盘滋养细胞PPARγ核转位的影响HTR-8/SVeno细胞在LPS（2μg/mL）暴露后0 h,2 h,6 h,12 h,24 h收集细胞,检测细胞中PPARγ核转位以及在细胞中定位情况。结果显示:LPS暴露后,HTR-8/SVeno细胞中PPARγ核转位水平从2 h开始明显下降,直到24 h;LPS处理明显抑制了人胎盘滋养细胞中PPARγ阳性细胞核数。HTR-8/SVeno细胞与RSG共培养后24 h,继续添加LPS（2μg/mL）共培养,24h后收集细胞,检测人胎盘滋养细胞PPARγ核转位情况以及在细胞中定位情况。研究结果发现:RSG共培养后,明显促进了人胎盘滋养细胞中PPARγ核转位水平;LPS暴露后,RSG诱导的PPARγ核转位明显被LPS抑制。细胞免疫荧光结果发现:RSG处理增加了人胎盘滋养细胞中PPARγ阳性细胞核数,LPS暴露后,RSG诱导的PPARγ阳性细胞核数的增多明显被抑制。结果表明:LPS暴露后抑制了人胎盘滋养细胞PPARγ。5.LPS暴露对小鼠胎盘以及人胎盘滋养细胞NF-κB信号的影响ICR孕鼠在GD16注射LPS（200μg/kg）,在LPS暴露后0 h,2 h,6 h,12 h,24 h取材,留取胎盘组织,检测胎盘NF-κB信号。研究结果显示:孕期LPS暴露以后,小鼠胎盘中NF-κB p65核蛋白水平在2 h和6 h明显升高,且在2 h升高的幅度明显大于6 h;小鼠胎盘中NF-κB p50核蛋白水平在2 h和6 h也明显升高,且在6 h达到顶峰。HTR-8/SVeno细胞在LPS（2μg/mL）暴露后0 h,2 h,6 h,12 h,24 h收集细胞,检测人胎盘滋养细胞NF-κB信号。研究结果发现:LPS暴露以后,HTR8/SVeno细胞中NF-κB p65核蛋白水平在6 h和12 h明显升高,且在6 h升高的幅度明显大于12 h。同样的,NF-κB p50核蛋白在LPS暴露后6 h和12 h表达明显增强,且在12 h表达最高。结果表明:LPS暴露后激活了小鼠胎盘和人胎盘滋养细胞NF-κB信号。6.LPS以NF-κB依赖的方式抑制人胎盘滋养细胞PPARγ核转位为了探究NF-κB p65在LPS抑制人胎盘滋养细胞PPARγ中的作用,本课题采用了PDTC来阻断NF-κB p65,拮抗LPS对PPARγ的抑制作用。PDTC预处理组和LPS+PDTC组在LPS暴露前2 h给予PDTC 100mΜ预处理,然后LPS组和LPS+PDTC组给予LPS（2μg/mL）共培养,Control组和PDTC组给予PBS。LPS暴露6 h后收集细胞,检测人胎盘滋养细胞NF-κB p65和PPARγ蛋白表达。研究结果显示:LPS暴露明显升高了人胎盘滋养细胞中NF-κB p65核蛋白表达,而PDTC预处理有效的降低了LPS诱导的人胎盘滋养细胞中NF-κB p65蛋白表达的升高。LPS暴露明显抑制了人胎盘滋养细胞中PPARγ核转位;虽然单独的PDTC预处理对人胎盘滋养细胞中PPARγ核转位没有影响,但是PDTC预处理明显的改善了LPS抑制PPARγ核转位为了更进一步验证NF-κB p65在LPS下调人胎盘滋养细胞PPARγ中的作用,本课题沉默NF-κB p65来减弱LPS对PPARγ的抑制作用。p65 siRNA组和LPS+p65siRNA组细胞预转染p65 siRNA 24 h后,LPS组和LPS+p65 siRNA组给予LPS（2μg/mL）共培养6 h,然后收集细胞检测PPARγ和11β-HSD2蛋白表达。研究结果显示:LPS抑制了人胎盘滋养细胞中PPARγ核蛋白表达;单独的p65 siRNA对PPARγ蛋白表达没有影响,但是预转染p65 siRNA可以有效的降低了LPS下调人胎盘滋养细胞中PPARγ核蛋白表达。进一步研究发现:LPS暴露抑制了人胎盘滋养细胞中11β-HSD2蛋白表达,预转染p65 siRNA可以有效减弱LPS抑制人胎盘滋养细胞中11β-HSD2蛋白表达。上述研究结果表明:LPS抑制人胎盘滋养细胞中PPARγ核转位是通过NF-κB p65依赖的方式。7.LPS促进人胎盘滋养细胞中NF-κB p65和PPARγ之间的相互作用为了进一步研究胎盘滋养细胞中NF-κB p65抑制PPARγ的作用机制,本课题采用了免疫共沉淀实验来验证NF-κB p65和PPARγ两种蛋白在细胞中的相互作用。将HTR-8/SVeno细胞分为四组,Control组,RSG组,LPS组和LPS+RSG组。LPS+RSG组和RSG组在LPS暴露前前24 h和12 h添加RSG(10^-6 M)共培养,在最后一次给予RSG后12 h添加LPS（2μg/mL）或PBS共培养,LPS暴露6 h后收集细胞。用Co-IP检测人胎盘滋养细胞细胞核和细胞浆中PPARγ和NF-κB p65之间的相互作用,用免疫荧光检测PPARγ和NF-κB p65在人胎盘滋养细胞定位情况。研究结果显示:采用Co-IP沉降人胎盘滋养细胞胞浆和胞核中PPARγ,然后检测NF-κB p65蛋白水平,结果发现LPS处理后,胞浆和胞核蛋白沉淀复合物中NF-κB p65表达增强,而LPS和RSG共处理组中NF-κB p65在胞浆和胞核沉淀复合物中表达继续升高。免疫荧光结果显示:LPS与RSG共培养后,NF-κB p65和PPARγ共同定位表达于人胎盘滋养细胞核中。以上研究结果表明:LPS与RSG共处理增强了NF-κB p65和PPARγ在细胞胞浆以及胞核之间的相互作用,阻止PPARγ由细胞胞浆转位进到胞核中,抑制PPARγ在细胞核中的转录活性。8.PPARγ介导的胎盘11β-HSD2下调与LPS诱导的胎儿生长受限关联的病例对照研究根据建立的胎盘标本库,将新生儿分为适于胎龄儿组（appropriate for gestational age,AGA）和小于胎龄儿（small for gestational age infant,SGA）组,以胎儿出生体重低于同孕龄同性别的第十个百分位数组为SGA组,体重高于这个水准的为AGA组。随机抽取46对AGA胎盘和SGA胎盘,检测胎盘中11β-HSD2蛋白表达以及NF-κB p65、PPAR-γ阳性细胞核数。以该人群临床资料为基础,分析胎盘11β-HSD2、NF-κB p65和PPARγ与SGA以及AGA之间的相关性,完成病例对照研究。研究结果发现:SGA组胎盘中11β-HSD2蛋白表达明显低于AGA组,SGA组胎盘中PPARγ阳性细胞核数明显少于AGA组,SGA组胎盘中NF-κB p65阳性细胞核数明显高于AGA组。进一步分析之间的相关性发现,AGA胎盘11β-HSD2蛋白表达与新生儿体重与呈正相关;SGA胎盘11β-HSD2蛋白表达与新生儿体重与呈正相关,胎盘PPARγ阳性细胞核数与新生儿体重呈正相关,胎盘NF-κB p65阳性细胞核数与新生儿体重呈负相关。本课题也分析蛋白之间的相关性,结果发现AGA胎盘上PPARγ阳性细胞核数与11β-HSD2蛋白表达呈正相关。SGA胎盘上PPARγ阳性细胞核数与11β-HSD2蛋白表达呈正相关;NF-κB p65阳性细胞核数与PPARγ阳性细胞核数呈负相关;NF-κB p65阳性细胞核数与11β-HSD2蛋白表达也呈负相关。综上所述,本研究进一步从人群中验证了PPARγ调节胎盘11β-HSD2的表达与LPS诱发的IUGR之间的相关性。根据以上实验结果可以得出如下结论:LPS暴露通过抑制PPARγ下调了胎盘滋养细胞中的11β-HSD2。机制学研究表明LPS通过增强人胎盘滋养细胞中NF-κB p65和PPARγ在胞浆和胞核之间的的相互作用抑制PPARγ核转位,降低PPARγ的转录活性,进而抑制下游的11β-HSD2。基于人群的病例对照研究发现PPARγ和11β-HSD2在SGA胎盘中均是下调的,新生儿体重与11β-HSD2呈正相关,11β-HSD2的表达与PPARγ阳性细胞核数呈正相关。这些结果表明PPARγ介导的胎盘11β-HSD2的下调可能在LPS诱发的胎儿生长受限中发挥着重要的作用。